人乳头瘤病毒基因分型核酸标记试剂盒及使用方法-好方法网

技术摘要：
本申请涉及一种人乳头瘤病毒基因分型核酸标记试剂盒及使用方法；所述的核酸标记试剂盒包括33个人乳头瘤病毒亚型核酸标记的引物对和探针。所述的核酸标记试剂盒包括PCR扩展反应体系：临床样本DNA或阴性质控模板5.0μL、PCR扩增试剂混合物12.5μL、PCR扩增引物混合物7.5 全部
背景技术：
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区 (L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。目前已确定的HPV型别大约有 100余种，依据不同型别致病力大小或致癌危险性大小，可分为高危型和低危型两大类。目前的试剂盒产品具有标记亚型少，操作繁琐复杂，可辨识度较低，容易发生误判等缺陷，考虑到对该病毒亚型众多，因此有一种新型的基因芯片，可以一次性、快速、准确得对其核酸进行标记，成为需要解决的技术问题。
技术实现要素：
本申请正是为了解决上述问题缺陷，提供一种人乳头瘤病毒基因分型核酸标记试剂盒及使用方法。本申请采用如下技术方案实现。人乳头瘤病毒基因分型核酸标记试剂盒，本申请所述的核酸标记试剂盒包括通用引物对①：GP5 (1)、Cy3-GP6 (1)或通用引物对②：GP5 (2)、Cy3-GP6 (2)与用于标记的探针。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒中用于标记的探针包括用于标记HPV6的探针：NH2-Oligo(15T)-CGTAACTACATCTTCCACATACACCAA；或用于标记HPV11的探针：NH2-Oligo(15T)-TGTGTCTAAATCTGCTACATACAC；或用于标记HPV16的探针：NH2-Oligo(15T)-TTATGTGCTGCCATATCTACTT；或用于标记HPV18的探针：NH2-Oligo(15T)-TCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA；或用于标记HPV26的探针：NH2-Oligo(15T)-CATTATCTGCAGCATCTGCATCCACT；或用于标记HPV31的探针：NH2-Oligo(15T)-TGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC；或用于标记HPV33的探针：NH2-Oligo(15T)-TTTATGCACACAAGTAACTAGTGAC；或用于标记HPV34的探针：NH2-Oligo(15T)-CAATCCACAAGTACAAATGCACCA；或用于标记HPV35的探针：NH2-Oligo(15T)-GTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT；或用于标记HPV39的探针：NH2-Oligo(15T)-TCTACCTCTATAGAGTCTTCCATA；或用于标记HPV40的探针：NH2-Oligo(15T)-CACACAGTCCCCCACACCAACCC；或用于标记HPV42的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCAACATCTGGTGATACATA； 5 CN 111607667 A 说　明　书 2/8 页或用于标记HPV43的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGACCCTACTGTGCCCAGTACATA；或用于标记HPV44的探针：NH2-Oligo(15T)-ACTACACAGTCCCCTCCGTCTAC；或用于标记HPV45的探针：NH2-Oligo(15T)-AAAATCCTGTGCCAAGTACAT；或用于标记HPV51的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCA；或用于标记HPV52的探针：NH2-Oligo(15T)-GAGGTTAAAAAGGAAAGCACATA；或用于标记HPV53的探针：NH2-Oligo(15T)-TCTACATATAATTCAAAGCAAAT；或用于标记HPV54的探针：NH2-Oligo(15T)-GCATCCACGCAGGATAGCTTTAAT；或用于标记HPV55的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCTACAACTCAGTCTCCATCTACA；或用于标记HPV56的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG；或用于标记HPV58的探针：NH2-Oligo(15T)-ATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC；或用于标记HPV59的探针：NH2-Oligo(15T)-TACTGCTTCTATTCCTAATGTATAC；或用于标记HPV61的探针：NH2-Oligo(15T)-GCTACATCCCCCCCTGTATCTGAATA；或用于标记HPV62的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCAGCAGAATACACGGCTACCAACT；或用于标记HPV66的探针：NH2-Oligo(15T)-TAATGCAGCTAAAAGCACATTAACTAA；或用于标记HPV68的探针：NH2-Oligo(15T)-TACTACTGAATCAGCTGTACCAAT；或用于标记HPV70的探针：NH2-Oligo(15T)-GCCTGCACCGAAACGGCCATACCTGCTG；或用于标记HPV72的探针：NH2-Oligo(15T)-CACAGCGTCCTCTGTATCAGAATATAC；或用于标记HPV73的探针：NH2-Oligo(15T)-AGGTACACAGGCTAGTAGCTCTACTA；或用于标记HPV83的探针：NH2-Oligo(15T)-TGCTGCTACACAGGCTAATGAATACA；或用于标记HPV84的探针：NH2-Oligo(15T)-CTGCTACCAACACCGAATCAGAATATA；或用于标记HPV81的探针：NH2-Oligo(15T)-CTACATCTGCTGCTGCAGAATACA；其中的任意一个或多个的组合。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括内参对照引物对：IC-RP、Cy3-IC-FP 与探针：NH2-Oligo(15T)-CATTGTAGAAGGTGTGGTGCCAGA。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括杂交对照探针HC：NH2-Oligo(15T)- TCAGGGTGAGGATGCC。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括阴性质控探针NC：N H 2 - TTTTTTTTTTTTTTTT。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括PCR扩展反应体系：临床样本DNA或阴性质控模板5.0μL、PCR扩增试剂混合物12.5μL、PCR扩增引物混合物7.5μL、PCR酶混合物1 μL，总体积25.0μL。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒的PCR扩展反应参数：95℃5min× 1cycle；(94℃30s，42℃50s，65℃45s)×35cycles；72℃10min×1cycle；4℃保存。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括基因芯片，该基因芯片设置为矩形，分上下N个部分，每个部分设置M个重复，在第1个部分的第1列设置为杂交对照位点，在第1 个部分的最后1列设置为阴性质控位点；在最后1个部分的第1列设置为内参对照位点，在最后1个部分的最后1列设置为杂交对照位点；其余位点设置为预标记待测样本位点。进一步为，本申请所述的核酸标记试剂盒包括洗脱液I和洗脱液II；洗脱液I：在芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水:20×SSC:10％SDS＝100:5:1的比例配制；洗脱液II：在 6 CN 111607667 A 说　明　书 3/8 页芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水:20×SSC:10％SDS＝400:1:4的比例配制；所述的洗脱液在基因芯片杂交后使用，具体为，先使用洗脱液I，震荡洗脱1min；再使用洗脱液II，震荡洗脱1min；洗脱完毕后，将芯片自然晾干或低速甩干。上述的核酸标记试剂盒的使用方法，本申请该方法包括如下以下步骤： (1)准备仪器和耗材：准备无菌操作台、生物安全柜、基因扩增仪、取样器、台式离心机、恒温热台、水浴恒温振荡器、载玻片架及玻片洗脱容器、芯片扫描仪； (2)配制洗脱液I和洗脱液II； (3)获取核酸样本或疑似核酸样本； (4)PCR扩增及标记； (5)杂交：5.1恒温热台升温恒定到42℃，用42℃预热的杂交模块将芯片固定好； 5.2将PCR产物置于PCR仪中，加热至95℃变性5min，立即冰浴3min； 5.3取75μL杂交缓冲液加入临床样本扩增反应管中充分混匀，将混合物由加样孔滴加入对应微阵列反应室内杂交60min；操作过程中禁止触碰到微阵列区，避免将混合液滴落到杂交模块表面； (6)洗脱：洗脱前将洗脱液在37℃预热，小心将芯片从杂交模块中取出，立即放入洗脱容器中，完成洗脱流程；洗脱液I，震荡洗脱1min；洗脱液II，震荡洗脱1min；洗脱完毕后，将芯片自然晾干或低速甩干即可进行扫描； (7)扫描：将干燥后的芯片置于激光扫描仪(晶芯LuxScan 10K)中使用532nm波长激光扫描，获得扫描数据及图谱；完成核酸标记。本申请的有益效果为，本申请的技术方法的引物对和探针具有极高的特异性，可以很好地标记病原体，从而节省了在数据分析方面所花费的时间，在更短的时间内得到多种病毒核酸标记的数据信息。本申请采用荧光标记的方式，可以同时对33种HPV病原体核酸进行标记，所显示的荧光标记图谱可以为医学专家后期分析提供帮助。下面结合附图和

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