技术摘要：
本发明涉及一种探针组合物，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断的探针组合物；还涉及相应的基因芯片和试剂盒。
背景技术：
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的高度接触性、致死性传染病。猪瘟被OIE列为必须报告的动物疫病之一， 在中国被列为“一类动物疫病”。非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒 (African Swine fevervirus,ASFV)引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，病程短，死 亡率高达100％。目前在我国这2种疾病均有流行，所以对其进行流行病学病原学检测及临 床的快速鉴别诊断具有十分重要的意义。目前对于猪瘟的防控，我国仍是以接种中国兽医 药品监察所自主研发的C株疫苗为主。尽管疫苗的接种对于猪瘟的预防取得了很大的成果， 世界上很多国家也已经消灭了猪瘟，但目前临床上缺少有效的诊断方法可以对猪瘟疫苗接 种与野毒感染予以鉴别区分。而非洲猪瘟在国际上尚无可用的有效疫苗和药物去治疗和预 防 目前，对于猪瘟病毒的检测方法例如病毒分离培养、免疫荧光检测和酶联免疫吸 附试验等虽然有其成功的应用，但在应对猪瘟野毒和疫苗的鉴别诊断问题上，往往一筹莫 展。分子生物学检测方法虽然能对猪瘟病毒的野毒和疫苗进行区分，但这些方法比较费时， 操作步骤较为复杂，且难以适用于大量的样本检测。而对于非洲猪瘟病毒的诊断，目前还是 以病毒分离及核酸检测还有血清学检测为主。因此，建立一种临床上既能区分猪瘟野毒感 染和疫苗免疫同时能鉴别诊断非洲猪瘟病毒的诊断方法十分必要。
技术实现要素：
近年来，基因芯片技术被广泛应用于医学领域，在基因功能表达、致病机理、临床 诊断、药物开发、生物学检测等研究方面取得突出成效。本发明立足于基因芯片技术，针对 非洲猪瘟病毒的保守序列选取靶位基因分别设计了一对针对该病毒株的检测引物和另外 两对鉴别区分猪瘟野毒及其疫苗的引物及相对应的探针，建立了一种可靠、快速的对猪瘟 野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒鉴别诊断基因芯片检测方法，并组装出对猪瘟野毒及其疫苗、 非洲猪瘟病毒鉴别诊断基因芯片检测试剂盒，为猪瘟野毒及疫苗、非洲猪瘟病毒的快速鉴 别诊断和规模化猪场的疫病流行病学调查提供技术支撑。 本申请因而提供了： 1 .一种探针组合物，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别的探 针组合物，其中的靶标探针包括： 针 对 猪 瘟 野 毒 的 探 针 C S F V - W - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 4 CN 111575404 A 说 明 书 2/14 页 针 对 猪 瘟 疫 苗 的 探 针 C S F V - V - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示， 针 对 非 洲 猪 瘟 病 毒 的 探 针 A S F V - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 3 ： TCACTACGGCTGATCTTGTGG所示。 2.一种基因芯片，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别的基因 芯片，其中，该基因芯片包括： 权利要求1所述的探针组合物，以及载体材料，所述探针组合物固定在载体材料 上。 3.根据项2所述的基因芯片，其中，所述基因芯片的载体材料为改性硅胶膜。 4.根据项3所述的基因芯片，其中，除了固定有如项1所述的3条靶标探针序列，所 述基因芯片的每个孔还固定有一条芯片反应质控探针和两条 PCR质控探针。 5.一种引物组合物，其是对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断时所 使用的扩增引物，其包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5’UTR保守区域设计引物，分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1：SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物，分别为CSFV-F2：SEQ.ID.NO .7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGAT和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8：CCTACCACAGTCACGGCT； 针对非洲猪瘟病毒ASFV的p72保守区域设计引物，分别为ASFV-F： SEQ.ID.NO.9： TTTTATATTAGTTGGGACACGGA和ASFV-R： SEQ.ID.NO.10：GAAAGTTAATAGCAGATGCCGAT。 6.一种试剂盒，其包括： 项2-4中任一项所述的基因芯片；以及项5所述的引物组， 所示试剂盒用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断。 7.根据项6所述的试剂盒，其还包括： 质控引物、质控质粒、阳性对照、阴性对照、热反应酶、无菌无核酸酶水、辣根过氧 化物酶、变性液A、洗脱液B、洗涤液C以及TMB显色液。 8.一种对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断的方法，该方法包括： -取得含有受试体DNA/RNA的样本，优选血液样本； -对该样本进行DNA/RNA提取； -使用引物组合物对提取到的DNA/RNA进行扩增； -使用经扩增的DNA/RNA与探针组合物进行杂交； -通过显色反应显示杂交结果以判断是否存在/共同存在猪瘟野毒、猪瘟疫苗、非 洲猪瘟病毒的阴性/阳性。 9.根据项8所示的方法，其中，所述引物组合物包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5’UTR保守区域设计引物，分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1：SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物，分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO.7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGA和CSFV-R2：SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT； 针对非洲猪瘟野毒ASF V - P的 p7 2保守区域设计引物，分别为ASF V - F ： S E Q .I D .N O .9：T T T T A T A T T A G T T G G G A C A C G G A和A S F V - R ： S E Q .I D .N O .1 0： 5 CN 111575404 A 说 明 书 3/14 页 GAAAGTTAATAGCAGATGCCGAT。 10.根据项8或9所示的方法，其中， 所述探针组合物包括： 针对猪瘟野毒C S F V - W的探针C S F V - W - P ，其序列如S E Q .I D .N O .1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 针对猪瘟疫苗C S F V - V的探针C S F V - V - P ，其序列如S E Q .I D .N O .2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示， 针对非洲猪瘟病毒 A S F V的探针 A S F V - P ，其序列如S E Q .I D .N O .3 ： TCACTACGGCTGATCTTGTGG所示。 附图说明 图1为基因芯片检测技术路线图。 图2为PCR产物示意图，图中，M表示Marker；1：表示SX4；2:表示BJYQ1；3:表示 Thiverval株；4：表示C-株；N表示阴性对照。 图3为PCR产物示意图，图中，M表示Marker；1：表示CSFV；2:表示PCV-1；3:表示PCV- 2；4:表示PPV；5：表示PRV；6：表示PRRSV；7：表示PEDV；8：表示TGEV；9：表示ASFV；10：表示 APPV；11：表示 FMDV；12：表示JEV；13：表示BVDV；14：表示阴性对照。 图4为芯片特异性实验示意图，图中CSFV/Shimen、CSFV/BJYQ1、 CSFV/SX4、CSFV/ HeBHD2、CSFV/HeBHH1、CSFV/HeBBD1、CSFV/TJNH1、 CSFV/HeBJZ1、CSFV/HeBQHD1、CSFV/ HeNZZ1、CSFV/HBES2、 CSFV/ZJHZ1、CSFV/HENZMD1、CSFV/HeNXC3、CSFV/JSXZ1、 CSFV/ GXFL1、CSFV/HeBCB2、CSFV/HENZMD2、CSFV/HeNXC1、 CSFV/HBHG1、CSFV/HBHM1、CSFV/HBJZ1、 CSFV/LNCY1、CSFV/SCMY1、 CSFV/HBXY4、CSFV/HBXY5、CSFV/ZYBJ1、CSFV/HeBBD4表示为检测 28株猪瘟病毒野毒株芯片检测阳性结果图；CSFV/Thiverval、CSFV/C株表示为检测2株猪瘟 疫苗株芯片检测阳性结果图；ASFV表示为单一检测非洲猪瘟病毒株芯片检测阳性结果图； APPV、FMDV、BVDV、PCV-1、PCV-2、 PRV、PPV、PRRSV、TGDV、PEDV、JEV分别表示为单一检测猪非 典型瘟病毒株、猪口蹄疫病毒株、牛病毒性腹泻毒株、猪圆环I型毒株、猪圆环II 型毒株、猪 伪狂犬病毒株、猪细小病毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒株、猪传染性胃肠炎病毒株、猪流 行性腹泻病毒株、猪乙型脑炎病毒株等临床常见 11种猪病芯片检测阴性结果图；CSFV ASFV表示为猪瘟野毒和疫苗株、非洲猪瘟毒株联检芯片检测阳性结果图；Negative表示为 双蒸水作为实验阴性对照。
本发明涉及一种探针组合物，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断的探针组合物；还涉及相应的基因芯片和试剂盒。
背景技术：
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的高度接触性、致死性传染病。猪瘟被OIE列为必须报告的动物疫病之一， 在中国被列为“一类动物疫病”。非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒 (African Swine fevervirus,ASFV)引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，病程短，死 亡率高达100％。目前在我国这2种疾病均有流行，所以对其进行流行病学病原学检测及临 床的快速鉴别诊断具有十分重要的意义。目前对于猪瘟的防控，我国仍是以接种中国兽医 药品监察所自主研发的C株疫苗为主。尽管疫苗的接种对于猪瘟的预防取得了很大的成果， 世界上很多国家也已经消灭了猪瘟，但目前临床上缺少有效的诊断方法可以对猪瘟疫苗接 种与野毒感染予以鉴别区分。而非洲猪瘟在国际上尚无可用的有效疫苗和药物去治疗和预 防 目前，对于猪瘟病毒的检测方法例如病毒分离培养、免疫荧光检测和酶联免疫吸 附试验等虽然有其成功的应用，但在应对猪瘟野毒和疫苗的鉴别诊断问题上，往往一筹莫 展。分子生物学检测方法虽然能对猪瘟病毒的野毒和疫苗进行区分，但这些方法比较费时， 操作步骤较为复杂，且难以适用于大量的样本检测。而对于非洲猪瘟病毒的诊断，目前还是 以病毒分离及核酸检测还有血清学检测为主。因此，建立一种临床上既能区分猪瘟野毒感 染和疫苗免疫同时能鉴别诊断非洲猪瘟病毒的诊断方法十分必要。
技术实现要素：
近年来，基因芯片技术被广泛应用于医学领域，在基因功能表达、致病机理、临床 诊断、药物开发、生物学检测等研究方面取得突出成效。本发明立足于基因芯片技术，针对 非洲猪瘟病毒的保守序列选取靶位基因分别设计了一对针对该病毒株的检测引物和另外 两对鉴别区分猪瘟野毒及其疫苗的引物及相对应的探针，建立了一种可靠、快速的对猪瘟 野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒鉴别诊断基因芯片检测方法，并组装出对猪瘟野毒及其疫苗、 非洲猪瘟病毒鉴别诊断基因芯片检测试剂盒，为猪瘟野毒及疫苗、非洲猪瘟病毒的快速鉴 别诊断和规模化猪场的疫病流行病学调查提供技术支撑。 本申请因而提供了： 1 .一种探针组合物，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别的探 针组合物，其中的靶标探针包括： 针 对 猪 瘟 野 毒 的 探 针 C S F V - W - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 4 CN 111575404 A 说 明 书 2/14 页 针 对 猪 瘟 疫 苗 的 探 针 C S F V - V - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示， 针 对 非 洲 猪 瘟 病 毒 的 探 针 A S F V - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 3 ： TCACTACGGCTGATCTTGTGG所示。 2.一种基因芯片，其是用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别的基因 芯片，其中，该基因芯片包括： 权利要求1所述的探针组合物，以及载体材料，所述探针组合物固定在载体材料 上。 3.根据项2所述的基因芯片，其中，所述基因芯片的载体材料为改性硅胶膜。 4.根据项3所述的基因芯片，其中，除了固定有如项1所述的3条靶标探针序列，所 述基因芯片的每个孔还固定有一条芯片反应质控探针和两条 PCR质控探针。 5.一种引物组合物，其是对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断时所 使用的扩增引物，其包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5’UTR保守区域设计引物，分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1：SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物，分别为CSFV-F2：SEQ.ID.NO .7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGAT和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8：CCTACCACAGTCACGGCT； 针对非洲猪瘟病毒ASFV的p72保守区域设计引物，分别为ASFV-F： SEQ.ID.NO.9： TTTTATATTAGTTGGGACACGGA和ASFV-R： SEQ.ID.NO.10：GAAAGTTAATAGCAGATGCCGAT。 6.一种试剂盒，其包括： 项2-4中任一项所述的基因芯片；以及项5所述的引物组， 所示试剂盒用于对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断。 7.根据项6所述的试剂盒，其还包括： 质控引物、质控质粒、阳性对照、阴性对照、热反应酶、无菌无核酸酶水、辣根过氧 化物酶、变性液A、洗脱液B、洗涤液C以及TMB显色液。 8.一种对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断的方法，该方法包括： -取得含有受试体DNA/RNA的样本，优选血液样本； -对该样本进行DNA/RNA提取； -使用引物组合物对提取到的DNA/RNA进行扩增； -使用经扩增的DNA/RNA与探针组合物进行杂交； -通过显色反应显示杂交结果以判断是否存在/共同存在猪瘟野毒、猪瘟疫苗、非 洲猪瘟病毒的阴性/阳性。 9.根据项8所示的方法，其中，所述引物组合物包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5’UTR保守区域设计引物，分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1：SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物，分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO.7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGA和CSFV-R2：SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT； 针对非洲猪瘟野毒ASF V - P的 p7 2保守区域设计引物，分别为ASF V - F ： S E Q .I D .N O .9：T T T T A T A T T A G T T G G G A C A C G G A和A S F V - R ： S E Q .I D .N O .1 0： 5 CN 111575404 A 说 明 书 3/14 页 GAAAGTTAATAGCAGATGCCGAT。 10.根据项8或9所示的方法，其中， 所述探针组合物包括： 针对猪瘟野毒C S F V - W的探针C S F V - W - P ，其序列如S E Q .I D .N O .1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 针对猪瘟疫苗C S F V - V的探针C S F V - V - P ，其序列如S E Q .I D .N O .2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示， 针对非洲猪瘟病毒 A S F V的探针 A S F V - P ，其序列如S E Q .I D .N O .3 ： TCACTACGGCTGATCTTGTGG所示。 附图说明 图1为基因芯片检测技术路线图。 图2为PCR产物示意图，图中，M表示Marker；1：表示SX4；2:表示BJYQ1；3:表示 Thiverval株；4：表示C-株；N表示阴性对照。 图3为PCR产物示意图，图中，M表示Marker；1：表示CSFV；2:表示PCV-1；3:表示PCV- 2；4:表示PPV；5：表示PRV；6：表示PRRSV；7：表示PEDV；8：表示TGEV；9：表示ASFV；10：表示 APPV；11：表示 FMDV；12：表示JEV；13：表示BVDV；14：表示阴性对照。 图4为芯片特异性实验示意图，图中CSFV/Shimen、CSFV/BJYQ1、 CSFV/SX4、CSFV/ HeBHD2、CSFV/HeBHH1、CSFV/HeBBD1、CSFV/TJNH1、 CSFV/HeBJZ1、CSFV/HeBQHD1、CSFV/ HeNZZ1、CSFV/HBES2、 CSFV/ZJHZ1、CSFV/HENZMD1、CSFV/HeNXC3、CSFV/JSXZ1、 CSFV/ GXFL1、CSFV/HeBCB2、CSFV/HENZMD2、CSFV/HeNXC1、 CSFV/HBHG1、CSFV/HBHM1、CSFV/HBJZ1、 CSFV/LNCY1、CSFV/SCMY1、 CSFV/HBXY4、CSFV/HBXY5、CSFV/ZYBJ1、CSFV/HeBBD4表示为检测 28株猪瘟病毒野毒株芯片检测阳性结果图；CSFV/Thiverval、CSFV/C株表示为检测2株猪瘟 疫苗株芯片检测阳性结果图；ASFV表示为单一检测非洲猪瘟病毒株芯片检测阳性结果图； APPV、FMDV、BVDV、PCV-1、PCV-2、 PRV、PPV、PRRSV、TGDV、PEDV、JEV分别表示为单一检测猪非 典型瘟病毒株、猪口蹄疫病毒株、牛病毒性腹泻毒株、猪圆环I型毒株、猪圆环II 型毒株、猪 伪狂犬病毒株、猪细小病毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒株、猪传染性胃肠炎病毒株、猪流 行性腹泻病毒株、猪乙型脑炎病毒株等临床常见 11种猪病芯片检测阴性结果图；CSFV ASFV表示为猪瘟野毒和疫苗株、非洲猪瘟毒株联检芯片检测阳性结果图；Negative表示为 双蒸水作为实验阴性对照。
