技术摘要：
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用，本发明的引物是针对油茶转录组hAT转座子设计的，设计出来的7对引物具有较高的多态信息含量(PIC)，有良好的多态性，能对油茶品种进行良好区分，本申请印证了利用普通油茶开发hAT  全部
背景技术：
】 油茶主要种植在南方亚热带地区，于南方的17个省丘陵地区广泛分布，广西的油 茶种植面积、年产量和产业总产值都位于全国第三。我国油茶种植范围广，面积大。但是产 量却长期处于低下的状况，其原因包括良种少、水平低、种质资源杂乱等等，根本原因为缺 乏良种。虽然在我国研究人员长期的共同努力下，已经取得了很多明显成果，但对油茶品种 的改良依旧存在着很多问题。一般而言，遗传育种的方法可以分为常规育种和分子育种两 种。分子育种具有育种周期较短、效率高、成本低、针对性强等的优点，促进了油茶产业的快 速发展，所以分子育种为改良油茶品种的首要选择方法。目前使用较多的分子标记包括： RAPD，AFLP，ISSR，SRAP和SSR等。然而RAPD的重复性差，AFLP技术操作较为复杂而且对于实 验操作人员和实验设备等有较高的要求，ISSR、SRAP存在多态性不丰富的缺点。SSR虽然是 共显性分子标记，但是其扩增产物大小相近，容易造成误判。 转座子是一类可移动元件，广泛分布在植物基因组中，其分为Ⅰ型转座子(ClassⅠ elements)和Ⅱ型转座子(ClassⅡelements)以及Helitron转座子三大类。Ⅰ型转座子又称 为反转座子(retrotransposn)，其在植物的基因组中最为常见。Ⅱ型转座子又叫DNA转座 子，DNA转座子是一类转座过程由DNA介导，通过“剪切—粘贴”进行转座的可移动元件。其优 点有拷贝数较多、插入位点的多态性丰富，适宜用于开发分子标记。而数量比较多的DNA转 座子为CACTA、hAT(hobo,Activator  and  Tam3)以及Mutator-like  element(MULE)超家族。 其中真核生物中普遍有hAT转座子存在，一些低等植物和无脊椎动物(如果蝇hobo、玉米Ac、 金鱼草)中的转座元件具有转座活性，已经被用作高效优质的遗传多样性分析工具。hAT转 座子中玉米Ac转座子最先被发现，hAT转座子的特征为：在转座过程中会产生8bp的靶位点 重复，大部分hAT转座子的大小都小于4kb，有5-27bp的短反向末端重复。hAT转座子标记为 共显性标记，能检测复等位基因，可以将纯合子和杂合子区分开来，重复性好，易于判断读 取，可以获得完整的遗传信息，在遗传多样性检测中更具备优势，因此开发共显性的、扩增 稳定的优质的普通油茶hAT分子转座子标记，更有利于油茶遗传多样性的研究。 目前还未发现有将hAT转座子应用在油茶方面，所以对转座子的深入了解，对促进 油茶遗传育种的理论和技术发展都有很重要的作用。故本研究利用普通油茶已有转录组分 析hAT转座子类型及其数量，开发出基于hAT转座子的分子标记，并在普通油茶种质资源库 中验证所开发的hAT转座子是否可行。为后续开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种 亲缘关系鉴别等研究提供新的引物。 【
技术实现要素：
】 鉴于上述内容，有必要提供一种基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及 3 CN 111607661 A 说　明　书 2/8 页 其应用，该引物组是基于hAT转座子应用开发的分子标记，该分子标记引物组具有具有拷贝 数多，重复性较好，容易产生丰富的遗传多样性、开发的引物具有高度多态性(PIC>0.7)。 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是： 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组，所述分子标记引物组为下述引物 中的任意1对： C o h A T 8上游引物：5’- A A A C G C A A T G T T T G T G A G C A - 3’；下游引物：5’- ATTGGAGATTGTCGCTGGAG-3’； C o h A T1 3上游引物：5’- T G G A C T AG T G T C C G T G T T C G - 3’；下游引物：5’- GGGGATTGAGTTGCAAGGTA-3’； C o h A T1 4上游引物：5’- C C A A T G A A A C T G C C A A A C A A - 3’；下游引物：5’- GGGGCAGATATGAAGGACAA-3’； C o h A T 3 2上游引物：5’- T A C C T C C A T G G C T T T G A T C C - 3’；下游引物：5’- GCGCTTCCTACTTCATTTGC-3’； C o h A T 4 5上游引物：5’- G T T G C A C T T G G T G G A AG G T T - 3’；下游引物：5’- GACCTGTCCGATCTTTTTGC-3’； C o h A T 5 3上游引物：5’- G T C AG G G G AG G T C C A T G T A A - 3’；下游引物：5’- GACGATCCTTGTCCCTTGAA-3’； C o h A T 5 6上游引物：5’- G C A AG A A T G G G A A T G C T G A T - 3’；下游引物：5’- TCTCCACCATCTCCGCTAAC-3’。 进一步的，所述引物组能对不同的油茶品种进行聚类分析。 进一步的，所述油茶品种为普通油茶、越南油茶、香花油茶 本发明还包括一种基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组的构建方法，所 述方法包括提取普通油茶的基因组DNA、对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行质量检 测、提取含有hAT转座元件的序列、根据hAT转座子两端的保守区域合成相应引物、用引物对 不同品种的油茶进行扩增，选取具有特异性的引物构建引物组。 进一步的，所述对测序完成的DNA序列进行质量检测的方法为检测N50，N90，GC含 量，N含量等信息评估测序质量，选取测序质量高的转录组；去除接头，低质量序列和不确定 的碱基；对修剪过的转录组进行组装、延伸。 进一步的，所述引物对不同品种的油茶进行扩增时的PCR反应体系为：ddH2O  3.6μ l，2×Taq的PCR  Master  Mix  5μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，DNA模板1μl；PCR扩增程 序为：预变性95℃4min；变性95℃45s，退火60℃45s，延伸72℃45s，33个循环；复性72℃ 7min；4℃下保存。 本发明还包括基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组的应用，该引物用于 检测不同油茶品种的亲缘关系及遗传多样性。 本发明具有如下有益效果： 本发明的引物是针对油茶转录组hAT转座子设计的，设计出来的7对引物具有较高 的多态信息含量(PIC)，有良好的多态性，能对油茶品种进行良好区分，本申请印证了利用 普通油茶开发hAT转座子标记的可行性，并对普通油茶、越南油茶、香花油茶三个品种的油 茶进行遗传多样性分析，不仅能为油茶提供新颖优质的分子标记，也为油茶的分子改良奠 4 CN 111607661 A 说　明　书 3/8 页 定良好基础可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提 供新引物。 【附图说明】 图1是本发明实施例中油茶的聚类分析图；图中，三角形代表普通油茶品种，方形 代表香花油茶，圆形代表越南油茶； 图2是本发明实施例中对油茶亚群进行分析的LnP(D)值曲线图。 【