技术摘要：
本发明公开了刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培养基及分离培养方法，所述培养基包括以下原料：9g‑19g琼脂、34g‑36g脑心浸液培养基、4g‑5.5g酵母提取物、0.3g‑0.5g半胱氨酸盐酸盐、8g‑10g胆汁盐、7g‑13g葡萄糖、0.3g‑0.6g柠檬酸铁铵、0.1mL‑1.2mL盐酸、0 全部
背景技术：
哺乳动物的肠道中含有复杂而且动态的微生物群体被称为“肠道微生物群”。肠道 微生物中含有细菌、真菌和病毒，作为宿主的一部分与宿主共同进化。有证据表明，肠道微 生物可以影响机体细胞的成熟和功能，并且介导宿主的抗感染免疫。肠道微生物移植有希 望用于提高动物抗感染能力，既可以节省花费又可以避免感染后抗生素使用所引发的超级 细菌的威胁，是现阶段科学研究中的重要内容。 肠道微生物是一个十分复杂的生态系统，如果利用微生物群体移植的方法提高动 物抗感染能力，将存在很大的未知风险。目前无法确保成功定植的菌群是否具有提高动物 抗感染的能力，也无法控制成功定植的微生物的增殖情况，如果过度增殖便具有引发新疾 病的风险，如果无法增殖便无法发挥提高动物抗感染的能力的作用。特异性的肠道微生物 对宿主免疫调节的研究日益深入，很多种肠道微生物对于提高机体抗感染能力的机理也日 渐清楚，特异性的肠道微生物菌种移植将会是一种安全高效的治疗手段。Th1细胞主要功能 为对抗细胞内寄生的细菌及原虫，其分泌的IFN-γ会活化巨噬细胞，使其能够吞噬并消化 掉细胞内寄生的细菌及原虫，另外IFN-γ也会活化iNOS而释放出自由基进而直接杀死细胞 内寄生的细菌及原虫。因而，现在急需特异性刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培 养方法，为肠道特异性菌种的具体作用机理的进一步研究与胞内寄生的细菌与原虫的治疗 提供帮助。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培养基及 分离培养方法，利用分离培养基从含有复杂微生物群体的哺乳动物粪便中分离培养提高动 物抗感染能力的目标菌种，为实现使用特异性的肠道微生物菌种移植的方法提高动物抗感 染能力提供了一种新的方法。 其具体技术方案为： 一种刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培养基，包括以下原料：9g-19g琼 脂、34g-36g脑心浸液培养基、4g-5.5g酵母提取物、0.3g-0.5g半胱氨酸盐酸盐、8g-10g胆汁 盐、7g-13g葡萄糖、0.3g-0.6g柠檬酸铁铵、0.1mL-1 .2mL盐酸、0.02g-1 .0g维生素K、0.1g- 1.2g血红素、1mg-7mg庆大霉素、40mg-135mg卡那霉素、8mg-42mg新生霉素、1000mL蒸馏水。 进一步，我们研究结果表明，如下配方为优选配方：15g琼脂、34g脑心浸液培养基、 4.5g酵母提取物、0.4g半胱氨酸盐酸盐、9g胆汁盐、7g葡萄糖、0.5g柠檬酸铁铵、0.1mL盐酸、 0.09g维生素K、0.5g血红素、6mg庆大霉素、129mg卡那霉素、41mg新生霉素、1000mL蒸馏水。 3 CN 111607520 A 说 明 书 2/3 页 本发明所述刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培养基的制备方法，具体 为：称量15g琼脂、34g脑心浸液培养基、4.5g酵母提取物、0.4g半胱氨酸盐酸盐、9g胆汁盐、 7g葡萄糖、0.5g柠檬酸铁铵、0.1mL盐酸，使用蒸馏水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌法进行灭 菌，待培养基冷却至42℃左右，无菌加入0.09g维生素K、0.5g血红素、6mg庆大霉素、129mg卡 那霉素、41mg新生霉素。 一种刺激Th1细胞增殖活化的肠道微生物的分离培养方法，包括以下步骤： 1)粪便中微生物的收集：无菌取机体直肠内容物于PBS溶液中，4500r/min -10000r/min(优选5000r/min)离心3min-8min(优选3min)，弃掉上清，重复2次； 2)目标菌种的分离：使用25mL-60mL(优选50mL)本发明所述的靶标菌分离培养基 重悬沉淀后，每孔1-2mL(优选2mL)加入到24孔聚苯乙烯板中，在标准厌氧培养条件下培养 4d-8d(优选7d)； 3)目标菌种的扩大培养：收集24孔聚苯乙烯板中的培养物进行培养，5000r/min离 心3min，弃掉上清，取20mL-70mL(优选50mL)本发明所述的靶标菌分离培养基重悬沉淀，加 入到24孔聚苯乙烯板中，在标准厌氧培养条件下再培养5d-8d(优选7d)。然后，将培养基更 换为靶标菌扩增培养基，再培养3d-9d(优选7d)。 4)目标菌种的收集：收集24孔聚苯乙烯板中的培养物，8000r/min-14000r/min(优 选9000r/min)离心5min，弃上清，沉淀用1.8mL无菌水重悬，-80℃冰箱中冻存备用。 与现有技术相比，本发明的有益效果为： 本发明从含有复杂微生物群体的哺乳动物粪便中分离培养刺激Th1细胞增殖活化 的肠道微生物的分离培养方法，操作方法简单，并且采用本发明特殊的培养基，使其分离菌 种纯度高，提高免疫力效果显著。 附图说明 图1为分离得到的肠道微生物移植到机体后，刺激Th1细胞活化的real-time PCR 结果。 图2为分离得到的肠道微生物移植到机体后，刺激Th1细胞活化的流式细胞术结 果。
