技术摘要：
小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减少性疾病药物中的应用。本发明利用OVX卵巢去势所致的绝经后骨质疏松小鼠模型、鼠尾悬吊所致的废用性骨质疏松小鼠模型，体内和原代骨髓来源细胞的体外分析以及基于细胞系的实验结果表明，Salubrinal给药可有效减轻OV 全部
背景技术：
内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞内负责蛋白质合成、折叠、组装 和修饰，脂质合 成以及细胞膜结构合成的重要细胞器，同时在调节细胞应激和细胞凋亡方 面有显著作用，因此在维持细 胞稳态方面，内质网扮演重要角色。多种生理或病理条件例 如蛋白质糖基化的抑制、钙离子的流失、蛋 白质不能形成正常的二硫键结合、突变蛋白表 达以及氧化还原状态的改变等会引起未折叠蛋白或错误折 叠蛋白在内质网聚集，损伤内 质网的正常生理功能，这种生理或病理改变称为内质网应激。IRE1(inositol requiring enzyme 1)、PERK(PKR-like ER kinase)和ATF6(activating transcription factor 6)三 种转录因 子在内质网应激中可被激活。PERK导致其下游真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，磷酸化的eIF2α可直接抑制蛋白合 成，减少未折叠或错误折叠蛋白的来源， 从而维持细胞内环境的稳态。但是，过强或长时间 的内质网应激反应，将会导致细胞内稳态失衡，出现 未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，引起细胞凋亡(apoptosis)。之前研究表明内质 网应激与各种疾病如糖尿 病、神经退行性疾病和成骨不全有关，但内质网应激在骨量减少症发病机制中 的作用仍不 清楚。 当内质网应激持续发生时，未折叠蛋白反应并不足以维持细胞稳态，细胞自噬被 激活。自噬的上调 是细胞去除未折叠或错误折叠蛋白质和细胞器的重要机制。在很多病理 状态下，如糖尿病中，内质网应 激的发生可以诱导自噬。在大脑缺血缺氧的病理状态下，自 噬活化可以降低UPR激活，表明内质网应 激与自噬之间存在相关性。然而，内质网应激和自 噬在骨质疏松和骨量减少性疾病中的重要作用仍需研 究。自噬参与了骨形成和再吸收之 间的平衡调节，可由UPR诱导。它是真核细胞中的细胞内降解系统， 可将细胞质成分(包括 受损的大分子和细胞器)输送到溶酶体中进行降解和再循环。自噬还能够调节骨 髓间充质 干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的再生功能并参与骨质疏松和骨 量 减少性疾病的发展。之前的研究表明，成骨细胞中的自噬缺乏会降低其矿化能力，并引 发成骨细胞和破 骨细胞之间的不平衡，从而导致低骨量表型。然而，绝经后骨质疏松中自 噬的确切功能机制仍需阐明。 骨量减少性疾病的临床表现症状为骨痛、骨关节炎、股骨头坏死等，严重可导致骨 质疏松。骨质疏 松和骨量减少性疾病会导致骨组织微结构改变、骨强度降低和骨折风险增 加。骨重建是一种持续的骨吸 收和骨重建过程，主要由破骨细胞和成骨细胞调控。骨重建 期间骨形成减少和/或骨吸收过度均可导致 骨质疏松和骨量减少。发明表明，在一些骨科 疾病的小鼠模型中，骨质疏松和骨量减少的发病机制与成 骨细胞中内质网应激可能存在 3 CN 111568904 A 说 明 书 2/15 页 一定的联系。例如，在绝经后骨质疏松以及糖皮质激素诱导的骨质疏松中 观察到成骨细胞 的细胞凋亡增加。人体骨质疏松的主要类型包括绝经后骨质疏松、废用性骨质疏松和糖 皮 质激素引起的骨质疏松。通常通过鼠尾悬吊或坐骨神经切除术来模拟动物的失重，以定量 评估废用性 骨质疏松的发展。然而，内质网应激可能参与骨质疏松发生发展的作用机制尚 需阐明。 在目前的发明中，鼠尾悬吊模型被用来发明骨质疏松的发病机制，以及内质网应 激和骨质疏松之间 的关系。此外，增强破骨细胞活性和抑制成骨细胞功能的机制仍有待澄 清。随着人口老龄化，骨质疏松， 特别是绝经后骨质疏松的医学和社会负担将会增加。绝经 后骨质疏松可以通过多种药物治疗，包括抗吸 收剂、合成代谢剂和针对硬化蛋白的新兴单 克隆疗法。然而，目前缺乏既刺激骨形成又抑制骨吸收的多 靶点靶向有效治疗药物。 Salubrinal是一种人工合成的小分子化合物(480Da，C21H17Cl3N4OS)，对eIF2α去磷 酸化的选择性 抑制剂，因此可以激活eIF2α磷酸化，保护细胞免于内质网应激诱导的细胞 凋亡。eIF2α的磷酸化水平 升高激活了活化转录因子4(activating transcription factor-4，ATF4)的翻译，这是骨形成的关键转录因 子之一，从而为eIF2α去磷酸化诱导的 疾病提供药物治疗的可能性。此外，eIF2α与Rho家族GTP酶相 互作用的机制，例如Rac1，其 在骨形成和骨吸收中起重要作用，仍然需进一步阐明。发明表明，Salubrinal 可改善糖尿 病、白血病、神经退行性疾病等，而Salubrinal在骨科疾病的发明还需深入研究。因此， Salubrinal对骨质疏松和骨量减少性疾病的治疗效果和机制还需探索。
技术实现要素：
本发明创造的目的在于提供如式(I)所示的小分子化合物Salubrinal在治疗或预 防骨质疏松和骨量 减少性疾病药物中的应用。 进一步，所述药物为能够对骨质疏松和骨量减少性疾病的发生、发展产生治疗、缓 解、抑制、调节 的有益作用的产品或潜在物质；所述药物为单一制剂或包含有效量制剂成 分的组合物，或者间充质干细 胞外泌体搭载Salubrinal的制剂，或者采用Salubrinal纳米 药物载体的制剂。 进一步，所述药物的应用方式为静脉注射、皮下注射、肌肉注射、口服、局部应用、 透皮吸收中的 一种或多种。 进一步，Salubrinal通过调控NFATc1和Rac1的表达抑制破骨细胞的骨吸收。 进一步，骨质疏松和骨量减少性疾病包括更年期骨质疏松、废用性骨质疏松、老年 性骨质疏松、糖 皮质激素骨质疏松、成骨不全、骨质疏松性骨关节炎、股骨头坏死、肿瘤骨 转移等相关疾病。 4 CN 111568904 A 说 明 书 3/15 页 骨在骨质疏松和骨量减少性疾病的发生发展过程中，内质网应激发挥重要作用。 轻度内质网应激引 起未折叠蛋白反应，调控细胞稳态，而时间过长或应激过强则引起细胞 自噬或凋亡，最终导致疾病的发 生。本发明为了证实Salubrinal通过调控eIF2α信号通路 治疗骨质疏松的机制，首先，采用鼠尾悬吊骨 丢失模型检测了内质网应激在骨质疏松发生 发展中的重要作用。不同时间点取材，进行组织学和骨髓细 胞实验，检测鼠尾悬吊对成骨 细胞分化和破骨细胞发育的作用，并进行了相关性分析。鼠尾悬吊诱导的 废用性骨质疏松 介导粗面内质网扩张，并调节Bip、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达，证明了内质网应激 参与了 废用性骨质疏松。而Salubrinal作为一个调控内质网应激信号通路的工具，通过调控内质 网应激 改善鼠尾悬吊引起的骨丢失。其次，采用卵巢去势的小鼠模型，进行透射电子显微 镜、Western blot和 免疫荧光分析，以评估Salubrinal对成骨细胞内质网应激和自噬的改 变。采用MC3T3-E1和RAW264.7 细胞系和骨髓原代细胞检测Salubrinal对成骨细胞和破骨 细胞的作用机制。通过BMD、μCT和组织学分 析在体内验证Salubrinal对OVX诱导的骨丢失 的改善作用。进一步分析Salubrinal治疗骨质疏松的机制。 本发明的有益效果如下： 1、通过发明内质网应激与骨质疏松发生发展的关系，探索eIF2α磷酸化在骨重建 的作用机制，从 而阐明eIF2α去磷酸化的靶向药物治疗的理论基础。 2、揭示Salubrinal药物既能促进成骨细胞的分化，又能抑制破骨细胞的发育； Salubrinal在促进骨 形成和抑制骨吸收双重作用的新型有效药物中使用。 3、验证Salubrinal通过调控内质网应激通路中eIF2α的磷酸化水平促进成骨细胞 自噬，抑制破骨细 胞NFATc1和Rac1 GTPase的表达，最终调节骨重建治疗骨质疏松和骨量 减少性疾病，以建立多靶点靶 向药物治疗新策略。 附图说明 图1(A)体重变化百分比。通过鼠尾悬吊实验，分别在第1、3、7和14天检测小鼠体重 变化。(B) 通过H&E染色(Bar＝200μm)测定股骨远端生长板近端的骨小梁的组织学参数。鼠 尾悬吊的小鼠表现 出B.Ar/T.Ar的时间依赖性降低趋势。箭头所指为骨小梁。(AC：年龄匹 配的对照组，HU：鼠尾悬吊组 (n＝6)。星号(*、**和***)分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001 的统计学差异性)。 图2鼠尾悬吊对成骨细胞和破骨细胞数目的影响。(A)MacNeal’s染色用于确定股 骨远端干骺端骨小 梁表面成骨细胞的数量。鼠尾悬吊组显示成骨细胞数量随时间减少。股 骨远端的代表性照片用于评估 N.Ob/BS/mm(Bar＝50μm)。箭头表示为位于骨小梁表面的成 骨细胞。(B)底部为代表性的照片(Bar ＝上部200μm，Bar＝底部50μm)。TRAP染色显示鼠尾 悬吊组TRAP阳性细胞数量的比率Oc.S/BS 呈时间依赖性增加。红色箭头指示为TRAP阳性细 胞(n＝6)。 图3鼠尾悬吊对破骨细胞发育和功能的影响。(A)鼠尾悬吊促进破骨细胞形成。底 部的显微镜照片代 表破骨细胞培养，其中TRAP染色用于比较年龄匹配对照组和鼠尾悬吊 组的小鼠破骨细胞表面积(1周； Bar＝200μm)。鼠尾悬吊对破骨细胞迁移(B)和粘附(C)的 影响。鼠尾悬吊组显著激活破骨细胞迁 移和粘附能力。底部为代表性的照片(Bar＝200μ m)。(D-E)鼠尾悬吊对CFU-M(D)和CFU-GM(E) 的影响。在鼠尾悬吊的小鼠中鼠尾悬吊诱导的 5 CN 111568904 A 说 明 书 4/15 页 CFU-M和CFU-GM显著增加。底部的图像表示2个不同 的组，其中圆圈表示CFU-M和CFU-GM的 集落(Bar＝500μm；n＝6)。 图4内质网应激在废用性骨质疏松发病机制中的作用。(A-E)为了研究内质网应激 在骨质疏松发病机 理中的作用，通过免疫印迹评估p-eIF2α/eIF2α。与年龄匹配的对照相 比，鼠尾悬吊组在短期内显著增加 Bip、p-eIF2α和ATF4的表达，但在长期内以时间依赖性 方式降低。CHOP的表达显示出时间依赖性显著 增加(n＝6)。 图5鼠尾悬吊和Salubrinal治疗对体重、μCT、BMD和BMC的影响。(A)Salubrinal抑 制鼠尾悬吊引起 的体重减轻。(B-C)Salubrinal的使用部分恢复鼠尾悬吊引起的股骨BMD (B)和BMC(C)的丢失。 (D-G)μCT图，在用Salubrinal(D)治疗2周后在纵向(顶部)和横向(底 部)横切面重建股骨，Salubrinal 抑制鼠尾悬吊引起的股骨BV/TV(E)降低、股骨的骨小梁 数量(Tb.N)(F)和股骨的骨小梁厚度(Tb.Th) (G)的降低。(H)Salubrinal治疗促进了鼠尾 悬吊引起的股骨的骨小梁间距(Tb.Sp)增加的恢复。(I) 通过H&E染色确定股骨远端生长板 近端的骨小梁的组织学参数。鼠尾悬吊组表现出较低的B.Ar/T.Ar比 率和Salubrinal治疗 增加股骨B.Ar/T.Ar.，右侧为股骨远端的组织学代表性照片(Bar＝500μm)(n＝6)。 箭头指 示为骨小梁。 图6成骨细胞内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示，在用 Salubrinal处理后，鼠尾 悬吊小鼠成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。粗面内质网用 红色箭头指示。N表示细胞核。Tb表 示骨小梁(Bar＝2μm)。(B)成骨细胞细胞质中粗面内质 网区的定量分析。测量粗面内质网面积的百 分比(n＝6)。 图7 Salubrinal对成骨细胞分化和骨髓腔细胞凋亡的影响。(A)Salubrinal诱导 的鼠尾悬吊小鼠中成骨 细胞数量的显著增加。下方为三组MacNeal’s染色的组织学代表性 显微照片(Bar＝50μm)。位于骨小 梁表面的成骨细胞用箭头指示。(B)使用DeadEnd TM荧光 TUNEL系统来检测在股骨远端骨髓腔中细 胞的凋亡。在鼠尾悬吊的小鼠中观察到 Salubrinal对鼠尾悬吊诱导的骨髓腔细胞凋亡的显著抑制。下方 为三组TUNEL染色的代表 性显微照片(Bar＝200μm)(n＝6)。箭头指示凋亡细胞。 图8 Salubrinal对成骨细胞集落形成单位-成纤维细胞集落形成的影响。(A)CFU- Ob的比较。(B)体 外0.5μM salubrinal给药对成骨细胞分化的影响。(C)CFU-F的比较。(D) 体外0.5μM Salubrinal给药 对CFU-F的影响。底部为显微镜下细胞学代表性图片(n＝6)。 图9体内使用Salubrinal对破骨细胞发育的影响。通过Salubrinal皮下注射显著 抑制鼠尾悬吊组中的破 骨细胞的数量。上方为代表性照片(Bar＝200μm)。股骨远端干骺端 的TRAP阳性细胞为红色，用黄色 箭头表示(n＝6)。 图10体内体外使用Salubrinal对破骨细胞形成的影响。(A)体内使用Salubrinal 抑制破骨细胞形成(Bar ＝200μm)。(B)体外Salubrinal给药对成熟破骨细胞形成的影响。 在从鼠尾悬吊小鼠分离的骨髓来源 的细胞中，Salubrinal以3种剂量(1、2和5μM)给药0-6 天或4-6天，结果显示Salubrinal以时间和 剂量依赖性的方式显著减少破骨细胞的表面积 比率。 图11体内体外使用Salubrinal对破骨细胞迁移、粘附能力的影响。(A)Salubrinal 诱导破骨细胞迁移数 目的减少。(B)体外发明显示，观察到破骨细胞迁移随着Salubrinal 药物浓度的增加，以剂量依赖性 的方式(1、2和5μM)显著减少。(C)Salubrinal减少了鼠尾 6 CN 111568904 A 说 明 书 5/15 页 悬吊引起的破骨细胞粘附数目的增加。 (D)体外发明还表明，破骨细胞粘附随着 Salubrinal药物浓度的增加，以剂量依赖性方式显著降低。 图12 Salubrinal给药对CFU-M和CFU-GM的影响。(A-B)Salubrinal诱导的鼠尾悬 吊小鼠中CFU-M(A) 和CFU-GM(B)数量的减少。图中圆圈表示集落(Bar＝500μm)。(C-D)在鼠 尾悬吊小鼠来源的骨 髓细胞中体外分别加入1、2和5μM Salubrinal，观察到CFU-M和CFU- GM以剂量依赖性方式显著降低 (Bar＝500μm)，底部为代表性图片。(n＝6)。 图13免疫组织化学染色和股骨远端NFATc1的定量分析。顶部为代表性图片。红色 圆圈中的为NFATc1 阳性细胞(Bar＝100μm)(n＝3)。 图14 Salubrinal体外和体内给药对内质网应激的影响。(A-B)分别对RAW264.7细 胞(A)和MC3T3-E1 细胞(B)的细胞活力进行MTT测定。(C)来自不同组的MC3T3-E1细胞的代 表性免疫荧光图像(蓝 色：DAPI，绿色：TUNEL 细胞，Bar＝100μm)。图片上部为TUNEL 细胞的 定量分析(S：Salubrinal 和Tm：衣霉素)。 图15 Salubrinal保护成骨细胞抑制内质网应激的蛋白质印迹分析的代表性图 像。(A)MC3T3-E1细胞系 的蛋白标本。(B)骨组织蛋白标本。右侧为定量分析。实验重复三次 (n＝3)。 图16成骨细胞自噬囊泡和内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示， 卵巢去势组中的 自噬囊泡数量明显减少，而Salubrinal处理组中成骨细胞中自噬囊泡的 数量明显增加。(B)在用Salubrinal 处理后，OVX成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。 粗面内质网用红色箭头表示。N表示细胞核。Tb 表示骨小梁(Bar＝2μm)。下方为成骨细胞细 胞质中粗面内质网区的定量分析。测量粗面内质网面积 的百分比(n＝6)。 图17 Salubrinal通过eIF2α调控体内外LC3和p62的表达促进成骨分化。(A-B)在 体内实验中，不同实 验组小鼠的股骨标本中Western blot的代表性图像。分别显示了Bip、 p-eIF2α、LC3II/I、p62和ALP的表 达水平。(C-D)在体外实验中，分离不同实验组小鼠的骨 髓细胞样本，eIF2αsiRNA对eIF2α蛋白水平 的部分沉默，检测了p-eIF2α、ALP、LC3II/I和 p62的蛋白质表达。该实验重复三次(n＝3)。 图18 Salubrinal通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬。(A)Atg7 siRNA对Atg7蛋白水 平的部分沉默。(B)成骨细胞系转染siRNA Atg7后，不同处理组细胞的 代表性免疫荧光图像(Salubrinal 通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬， 蓝色：DAPI，红色：LC3)。(C)Bip、Atg7、 LC3II/I、p62不同处理后蛋白质免疫印迹分析代表 性图像，实验重复三次(NC＝用非特异性对照siRNA 处理组，S：Salubrinal，Tm：衣霉素， 3MA：一种自噬抑制剂，rapa：雷帕霉素，Bar＝50μm)。 图19 Salubrinal促进体外成骨细胞的分化及矿化(A-B)CFU-F和CFU-OB的比较。 从3组小鼠(Sham、 OVX和注射Salubrinal的OVX小鼠)中分离骨髓来源的细胞。(C)在成骨细 胞诱导培养基中培养后， 测定成骨细胞矿化(茜素红染色)。图为代表性的照片(n＝6)。 图20 MacNeal’s染色。Salubrinal诱导OVX小鼠中成骨细胞数量的增加。下方为代 表性照片(Bar＝50μm)。 位于骨小梁表面的成骨细胞用箭头表示(n＝6)。 图21 Salubrinal抑制破骨细胞系NFATc1的表达。(A-D)加入5-20μM的Salubrinal 降低RAW264.7细 胞中NFATc1、组织蛋白酶K、DcStamp和Atp6v0d2的mRNA水平。(E)加入5-20 μM的Salubrinal， RAW264.7细胞中NFATc1以剂量依赖性的方式降低。(F)通过Salubrinal 7 CN 111568904 A 说 明 书 6/15 页 给药减少基于荧光的破骨细 胞活性。 图22Salubrinal对Rac1 GTP酶活性的影响。(A-B)YFP/CFP发射比在整个细胞上取 平均值，并将时间-10 min作为标准(Salubrinal处理前10min)。(bar＝10μm)。(C)eIF2α siRNA对eIF2α蛋白水平的 部分沉默，加入20μM Salubrinal对Rac1活性的作用。NC＝用非 特异性对照siRNA处理组。 图23 Rac1 siRNA对TRAP和组织蛋白酶K表达的作用。(A)Rac1 siRNA对Rac1蛋白 水平的部分沉默， 以及NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的蛋白表达。NC＝用非特异性对照 siRNA处理。(B)部分沉默Rac1 后的NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的相对mRNA水平。Rac1 siRNA降低了TRAP和组织蛋白酶K的表 达，但NFATc1表达保持不变。 图24 Salubrinal对破骨细胞的影响。(A)成熟破骨细胞的覆盖面积。Salubrinal 抑制OVX诱导的破骨细 胞区域的增加。(B)破骨细胞的迁移试验。Salubrinal给药减少了 OVX诱导的破骨细胞迁移的增加。 (C)破骨细胞的粘附测定。Salubrinal减少了OVX诱导的 破骨细胞粘附增加(n＝6)。 图25 Salubrinal体外给药对破骨细胞活性的影响。(A)将Salubrinal以3个剂量 (1，2和5μM)加入 从OVX小鼠分离的骨髓来源的细胞，处理0-6天或4-6天。右侧的四对图像 显示TRAP染色的代表性破 骨细胞。(Bar＝200μm)。上图：0-6天体外给药Salubrinal的效 果，实验重复三次。每孔计数5个视 野。下图：4-6天体外Salubrinal给药的影响。(B)破骨细 胞的迁移。(C)破骨细胞的粘附(n＝6)。 图26 Salubrinal体内给药对破骨细胞的影响。(A)TRAP染色。股骨远端生长盘近 侧骨小梁的TRAP阳 性细胞为红色，用红色箭头表示。(B)RANKL，组织蛋白酶K和NFATc1的免 疫印迹分析代表性图像。 实验重复三次(n＝9)。 图27 Salubrinal改善OVX引起的骨丢失表征。(A)卵巢去势和给药Salubrinal对 体重，BMD和BMC的 影响。(A)Salubrinal抑制OVX诱导的体重增加。(B)Salubrinal给药抑制 OVX诱导的腰椎、股骨和 胫骨中BMD和BMC的减少。(C)μCT代表性图像。纵向(顶部)和横向 (底部)横切面股骨重建图 像。(D-G)在使用Salubrinal治疗4周后，Salubrinal改善OVX诱 导的股骨BV/TV减少(D)、股骨小 梁数(Tb.N)(E)和股骨小梁厚度(Tb.Th)的减少(F)，并抑 制骨小梁分离度(Tb.Sp)的增加(G)。 (H)股骨远端H&E染色。黑色箭头所指为骨小梁。(I)钙 黄绿素标记的皮质骨，MAR为矿物沉积率 (n＝16)。
小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减少性疾病药物中的应用。本发明利用OVX卵巢去势所致的绝经后骨质疏松小鼠模型、鼠尾悬吊所致的废用性骨质疏松小鼠模型，体内和原代骨髓来源细胞的体外分析以及基于细胞系的实验结果表明，Salubrinal给药可有效减轻OV 全部
背景技术：
内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞内负责蛋白质合成、折叠、组装 和修饰，脂质合 成以及细胞膜结构合成的重要细胞器，同时在调节细胞应激和细胞凋亡方 面有显著作用，因此在维持细 胞稳态方面，内质网扮演重要角色。多种生理或病理条件例 如蛋白质糖基化的抑制、钙离子的流失、蛋 白质不能形成正常的二硫键结合、突变蛋白表 达以及氧化还原状态的改变等会引起未折叠蛋白或错误折 叠蛋白在内质网聚集，损伤内 质网的正常生理功能，这种生理或病理改变称为内质网应激。IRE1(inositol requiring enzyme 1)、PERK(PKR-like ER kinase)和ATF6(activating transcription factor 6)三 种转录因 子在内质网应激中可被激活。PERK导致其下游真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，磷酸化的eIF2α可直接抑制蛋白合 成，减少未折叠或错误折叠蛋白的来源， 从而维持细胞内环境的稳态。但是，过强或长时间 的内质网应激反应，将会导致细胞内稳态失衡，出现 未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，引起细胞凋亡(apoptosis)。之前研究表明内质 网应激与各种疾病如糖尿 病、神经退行性疾病和成骨不全有关，但内质网应激在骨量减少症发病机制中 的作用仍不 清楚。 当内质网应激持续发生时，未折叠蛋白反应并不足以维持细胞稳态，细胞自噬被 激活。自噬的上调 是细胞去除未折叠或错误折叠蛋白质和细胞器的重要机制。在很多病理 状态下，如糖尿病中，内质网应 激的发生可以诱导自噬。在大脑缺血缺氧的病理状态下，自 噬活化可以降低UPR激活，表明内质网应 激与自噬之间存在相关性。然而，内质网应激和自 噬在骨质疏松和骨量减少性疾病中的重要作用仍需研 究。自噬参与了骨形成和再吸收之 间的平衡调节，可由UPR诱导。它是真核细胞中的细胞内降解系统， 可将细胞质成分(包括 受损的大分子和细胞器)输送到溶酶体中进行降解和再循环。自噬还能够调节骨 髓间充质 干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的再生功能并参与骨质疏松和骨 量 减少性疾病的发展。之前的研究表明，成骨细胞中的自噬缺乏会降低其矿化能力，并引 发成骨细胞和破 骨细胞之间的不平衡，从而导致低骨量表型。然而，绝经后骨质疏松中自 噬的确切功能机制仍需阐明。 骨量减少性疾病的临床表现症状为骨痛、骨关节炎、股骨头坏死等，严重可导致骨 质疏松。骨质疏 松和骨量减少性疾病会导致骨组织微结构改变、骨强度降低和骨折风险增 加。骨重建是一种持续的骨吸 收和骨重建过程，主要由破骨细胞和成骨细胞调控。骨重建 期间骨形成减少和/或骨吸收过度均可导致 骨质疏松和骨量减少。发明表明，在一些骨科 疾病的小鼠模型中，骨质疏松和骨量减少的发病机制与成 骨细胞中内质网应激可能存在 3 CN 111568904 A 说 明 书 2/15 页 一定的联系。例如，在绝经后骨质疏松以及糖皮质激素诱导的骨质疏松中 观察到成骨细胞 的细胞凋亡增加。人体骨质疏松的主要类型包括绝经后骨质疏松、废用性骨质疏松和糖 皮 质激素引起的骨质疏松。通常通过鼠尾悬吊或坐骨神经切除术来模拟动物的失重，以定量 评估废用性 骨质疏松的发展。然而，内质网应激可能参与骨质疏松发生发展的作用机制尚 需阐明。 在目前的发明中，鼠尾悬吊模型被用来发明骨质疏松的发病机制，以及内质网应 激和骨质疏松之间 的关系。此外，增强破骨细胞活性和抑制成骨细胞功能的机制仍有待澄 清。随着人口老龄化，骨质疏松， 特别是绝经后骨质疏松的医学和社会负担将会增加。绝经 后骨质疏松可以通过多种药物治疗，包括抗吸 收剂、合成代谢剂和针对硬化蛋白的新兴单 克隆疗法。然而，目前缺乏既刺激骨形成又抑制骨吸收的多 靶点靶向有效治疗药物。 Salubrinal是一种人工合成的小分子化合物(480Da，C21H17Cl3N4OS)，对eIF2α去磷 酸化的选择性 抑制剂，因此可以激活eIF2α磷酸化，保护细胞免于内质网应激诱导的细胞 凋亡。eIF2α的磷酸化水平 升高激活了活化转录因子4(activating transcription factor-4，ATF4)的翻译，这是骨形成的关键转录因 子之一，从而为eIF2α去磷酸化诱导的 疾病提供药物治疗的可能性。此外，eIF2α与Rho家族GTP酶相 互作用的机制，例如Rac1，其 在骨形成和骨吸收中起重要作用，仍然需进一步阐明。发明表明，Salubrinal 可改善糖尿 病、白血病、神经退行性疾病等，而Salubrinal在骨科疾病的发明还需深入研究。因此， Salubrinal对骨质疏松和骨量减少性疾病的治疗效果和机制还需探索。
技术实现要素：
本发明创造的目的在于提供如式(I)所示的小分子化合物Salubrinal在治疗或预 防骨质疏松和骨量 减少性疾病药物中的应用。 进一步，所述药物为能够对骨质疏松和骨量减少性疾病的发生、发展产生治疗、缓 解、抑制、调节 的有益作用的产品或潜在物质；所述药物为单一制剂或包含有效量制剂成 分的组合物，或者间充质干细 胞外泌体搭载Salubrinal的制剂，或者采用Salubrinal纳米 药物载体的制剂。 进一步，所述药物的应用方式为静脉注射、皮下注射、肌肉注射、口服、局部应用、 透皮吸收中的 一种或多种。 进一步，Salubrinal通过调控NFATc1和Rac1的表达抑制破骨细胞的骨吸收。 进一步，骨质疏松和骨量减少性疾病包括更年期骨质疏松、废用性骨质疏松、老年 性骨质疏松、糖 皮质激素骨质疏松、成骨不全、骨质疏松性骨关节炎、股骨头坏死、肿瘤骨 转移等相关疾病。 4 CN 111568904 A 说 明 书 3/15 页 骨在骨质疏松和骨量减少性疾病的发生发展过程中，内质网应激发挥重要作用。 轻度内质网应激引 起未折叠蛋白反应，调控细胞稳态，而时间过长或应激过强则引起细胞 自噬或凋亡，最终导致疾病的发 生。本发明为了证实Salubrinal通过调控eIF2α信号通路 治疗骨质疏松的机制，首先，采用鼠尾悬吊骨 丢失模型检测了内质网应激在骨质疏松发生 发展中的重要作用。不同时间点取材，进行组织学和骨髓细 胞实验，检测鼠尾悬吊对成骨 细胞分化和破骨细胞发育的作用，并进行了相关性分析。鼠尾悬吊诱导的 废用性骨质疏松 介导粗面内质网扩张，并调节Bip、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达，证明了内质网应激 参与了 废用性骨质疏松。而Salubrinal作为一个调控内质网应激信号通路的工具，通过调控内质 网应激 改善鼠尾悬吊引起的骨丢失。其次，采用卵巢去势的小鼠模型，进行透射电子显微 镜、Western blot和 免疫荧光分析，以评估Salubrinal对成骨细胞内质网应激和自噬的改 变。采用MC3T3-E1和RAW264.7 细胞系和骨髓原代细胞检测Salubrinal对成骨细胞和破骨 细胞的作用机制。通过BMD、μCT和组织学分 析在体内验证Salubrinal对OVX诱导的骨丢失 的改善作用。进一步分析Salubrinal治疗骨质疏松的机制。 本发明的有益效果如下： 1、通过发明内质网应激与骨质疏松发生发展的关系，探索eIF2α磷酸化在骨重建 的作用机制，从 而阐明eIF2α去磷酸化的靶向药物治疗的理论基础。 2、揭示Salubrinal药物既能促进成骨细胞的分化，又能抑制破骨细胞的发育； Salubrinal在促进骨 形成和抑制骨吸收双重作用的新型有效药物中使用。 3、验证Salubrinal通过调控内质网应激通路中eIF2α的磷酸化水平促进成骨细胞 自噬，抑制破骨细 胞NFATc1和Rac1 GTPase的表达，最终调节骨重建治疗骨质疏松和骨量 减少性疾病，以建立多靶点靶 向药物治疗新策略。 附图说明 图1(A)体重变化百分比。通过鼠尾悬吊实验，分别在第1、3、7和14天检测小鼠体重 变化。(B) 通过H&E染色(Bar＝200μm)测定股骨远端生长板近端的骨小梁的组织学参数。鼠 尾悬吊的小鼠表现 出B.Ar/T.Ar的时间依赖性降低趋势。箭头所指为骨小梁。(AC：年龄匹 配的对照组，HU：鼠尾悬吊组 (n＝6)。星号(*、**和***)分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001 的统计学差异性)。 图2鼠尾悬吊对成骨细胞和破骨细胞数目的影响。(A)MacNeal’s染色用于确定股 骨远端干骺端骨小 梁表面成骨细胞的数量。鼠尾悬吊组显示成骨细胞数量随时间减少。股 骨远端的代表性照片用于评估 N.Ob/BS/mm(Bar＝50μm)。箭头表示为位于骨小梁表面的成 骨细胞。(B)底部为代表性的照片(Bar ＝上部200μm，Bar＝底部50μm)。TRAP染色显示鼠尾 悬吊组TRAP阳性细胞数量的比率Oc.S/BS 呈时间依赖性增加。红色箭头指示为TRAP阳性细 胞(n＝6)。 图3鼠尾悬吊对破骨细胞发育和功能的影响。(A)鼠尾悬吊促进破骨细胞形成。底 部的显微镜照片代 表破骨细胞培养，其中TRAP染色用于比较年龄匹配对照组和鼠尾悬吊 组的小鼠破骨细胞表面积(1周； Bar＝200μm)。鼠尾悬吊对破骨细胞迁移(B)和粘附(C)的 影响。鼠尾悬吊组显著激活破骨细胞迁 移和粘附能力。底部为代表性的照片(Bar＝200μ m)。(D-E)鼠尾悬吊对CFU-M(D)和CFU-GM(E) 的影响。在鼠尾悬吊的小鼠中鼠尾悬吊诱导的 5 CN 111568904 A 说 明 书 4/15 页 CFU-M和CFU-GM显著增加。底部的图像表示2个不同 的组，其中圆圈表示CFU-M和CFU-GM的 集落(Bar＝500μm；n＝6)。 图4内质网应激在废用性骨质疏松发病机制中的作用。(A-E)为了研究内质网应激 在骨质疏松发病机 理中的作用，通过免疫印迹评估p-eIF2α/eIF2α。与年龄匹配的对照相 比，鼠尾悬吊组在短期内显著增加 Bip、p-eIF2α和ATF4的表达，但在长期内以时间依赖性 方式降低。CHOP的表达显示出时间依赖性显著 增加(n＝6)。 图5鼠尾悬吊和Salubrinal治疗对体重、μCT、BMD和BMC的影响。(A)Salubrinal抑 制鼠尾悬吊引起 的体重减轻。(B-C)Salubrinal的使用部分恢复鼠尾悬吊引起的股骨BMD (B)和BMC(C)的丢失。 (D-G)μCT图，在用Salubrinal(D)治疗2周后在纵向(顶部)和横向(底 部)横切面重建股骨，Salubrinal 抑制鼠尾悬吊引起的股骨BV/TV(E)降低、股骨的骨小梁 数量(Tb.N)(F)和股骨的骨小梁厚度(Tb.Th) (G)的降低。(H)Salubrinal治疗促进了鼠尾 悬吊引起的股骨的骨小梁间距(Tb.Sp)增加的恢复。(I) 通过H&E染色确定股骨远端生长板 近端的骨小梁的组织学参数。鼠尾悬吊组表现出较低的B.Ar/T.Ar比 率和Salubrinal治疗 增加股骨B.Ar/T.Ar.，右侧为股骨远端的组织学代表性照片(Bar＝500μm)(n＝6)。 箭头指 示为骨小梁。 图6成骨细胞内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示，在用 Salubrinal处理后，鼠尾 悬吊小鼠成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。粗面内质网用 红色箭头指示。N表示细胞核。Tb表 示骨小梁(Bar＝2μm)。(B)成骨细胞细胞质中粗面内质 网区的定量分析。测量粗面内质网面积的百 分比(n＝6)。 图7 Salubrinal对成骨细胞分化和骨髓腔细胞凋亡的影响。(A)Salubrinal诱导 的鼠尾悬吊小鼠中成骨 细胞数量的显著增加。下方为三组MacNeal’s染色的组织学代表性 显微照片(Bar＝50μm)。位于骨小 梁表面的成骨细胞用箭头指示。(B)使用DeadEnd TM荧光 TUNEL系统来检测在股骨远端骨髓腔中细 胞的凋亡。在鼠尾悬吊的小鼠中观察到 Salubrinal对鼠尾悬吊诱导的骨髓腔细胞凋亡的显著抑制。下方 为三组TUNEL染色的代表 性显微照片(Bar＝200μm)(n＝6)。箭头指示凋亡细胞。 图8 Salubrinal对成骨细胞集落形成单位-成纤维细胞集落形成的影响。(A)CFU- Ob的比较。(B)体 外0.5μM salubrinal给药对成骨细胞分化的影响。(C)CFU-F的比较。(D) 体外0.5μM Salubrinal给药 对CFU-F的影响。底部为显微镜下细胞学代表性图片(n＝6)。 图9体内使用Salubrinal对破骨细胞发育的影响。通过Salubrinal皮下注射显著 抑制鼠尾悬吊组中的破 骨细胞的数量。上方为代表性照片(Bar＝200μm)。股骨远端干骺端 的TRAP阳性细胞为红色，用黄色 箭头表示(n＝6)。 图10体内体外使用Salubrinal对破骨细胞形成的影响。(A)体内使用Salubrinal 抑制破骨细胞形成(Bar ＝200μm)。(B)体外Salubrinal给药对成熟破骨细胞形成的影响。 在从鼠尾悬吊小鼠分离的骨髓来源 的细胞中，Salubrinal以3种剂量(1、2和5μM)给药0-6 天或4-6天，结果显示Salubrinal以时间和 剂量依赖性的方式显著减少破骨细胞的表面积 比率。 图11体内体外使用Salubrinal对破骨细胞迁移、粘附能力的影响。(A)Salubrinal 诱导破骨细胞迁移数 目的减少。(B)体外发明显示，观察到破骨细胞迁移随着Salubrinal 药物浓度的增加，以剂量依赖性 的方式(1、2和5μM)显著减少。(C)Salubrinal减少了鼠尾 6 CN 111568904 A 说 明 书 5/15 页 悬吊引起的破骨细胞粘附数目的增加。 (D)体外发明还表明，破骨细胞粘附随着 Salubrinal药物浓度的增加，以剂量依赖性方式显著降低。 图12 Salubrinal给药对CFU-M和CFU-GM的影响。(A-B)Salubrinal诱导的鼠尾悬 吊小鼠中CFU-M(A) 和CFU-GM(B)数量的减少。图中圆圈表示集落(Bar＝500μm)。(C-D)在鼠 尾悬吊小鼠来源的骨 髓细胞中体外分别加入1、2和5μM Salubrinal，观察到CFU-M和CFU- GM以剂量依赖性方式显著降低 (Bar＝500μm)，底部为代表性图片。(n＝6)。 图13免疫组织化学染色和股骨远端NFATc1的定量分析。顶部为代表性图片。红色 圆圈中的为NFATc1 阳性细胞(Bar＝100μm)(n＝3)。 图14 Salubrinal体外和体内给药对内质网应激的影响。(A-B)分别对RAW264.7细 胞(A)和MC3T3-E1 细胞(B)的细胞活力进行MTT测定。(C)来自不同组的MC3T3-E1细胞的代 表性免疫荧光图像(蓝 色：DAPI，绿色：TUNEL 细胞，Bar＝100μm)。图片上部为TUNEL 细胞的 定量分析(S：Salubrinal 和Tm：衣霉素)。 图15 Salubrinal保护成骨细胞抑制内质网应激的蛋白质印迹分析的代表性图 像。(A)MC3T3-E1细胞系 的蛋白标本。(B)骨组织蛋白标本。右侧为定量分析。实验重复三次 (n＝3)。 图16成骨细胞自噬囊泡和内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示， 卵巢去势组中的 自噬囊泡数量明显减少，而Salubrinal处理组中成骨细胞中自噬囊泡的 数量明显增加。(B)在用Salubrinal 处理后，OVX成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。 粗面内质网用红色箭头表示。N表示细胞核。Tb 表示骨小梁(Bar＝2μm)。下方为成骨细胞细 胞质中粗面内质网区的定量分析。测量粗面内质网面积 的百分比(n＝6)。 图17 Salubrinal通过eIF2α调控体内外LC3和p62的表达促进成骨分化。(A-B)在 体内实验中，不同实 验组小鼠的股骨标本中Western blot的代表性图像。分别显示了Bip、 p-eIF2α、LC3II/I、p62和ALP的表 达水平。(C-D)在体外实验中，分离不同实验组小鼠的骨 髓细胞样本，eIF2αsiRNA对eIF2α蛋白水平 的部分沉默，检测了p-eIF2α、ALP、LC3II/I和 p62的蛋白质表达。该实验重复三次(n＝3)。 图18 Salubrinal通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬。(A)Atg7 siRNA对Atg7蛋白水 平的部分沉默。(B)成骨细胞系转染siRNA Atg7后，不同处理组细胞的 代表性免疫荧光图像(Salubrinal 通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬， 蓝色：DAPI，红色：LC3)。(C)Bip、Atg7、 LC3II/I、p62不同处理后蛋白质免疫印迹分析代表 性图像，实验重复三次(NC＝用非特异性对照siRNA 处理组，S：Salubrinal，Tm：衣霉素， 3MA：一种自噬抑制剂，rapa：雷帕霉素，Bar＝50μm)。 图19 Salubrinal促进体外成骨细胞的分化及矿化(A-B)CFU-F和CFU-OB的比较。 从3组小鼠(Sham、 OVX和注射Salubrinal的OVX小鼠)中分离骨髓来源的细胞。(C)在成骨细 胞诱导培养基中培养后， 测定成骨细胞矿化(茜素红染色)。图为代表性的照片(n＝6)。 图20 MacNeal’s染色。Salubrinal诱导OVX小鼠中成骨细胞数量的增加。下方为代 表性照片(Bar＝50μm)。 位于骨小梁表面的成骨细胞用箭头表示(n＝6)。 图21 Salubrinal抑制破骨细胞系NFATc1的表达。(A-D)加入5-20μM的Salubrinal 降低RAW264.7细 胞中NFATc1、组织蛋白酶K、DcStamp和Atp6v0d2的mRNA水平。(E)加入5-20 μM的Salubrinal， RAW264.7细胞中NFATc1以剂量依赖性的方式降低。(F)通过Salubrinal 7 CN 111568904 A 说 明 书 6/15 页 给药减少基于荧光的破骨细 胞活性。 图22Salubrinal对Rac1 GTP酶活性的影响。(A-B)YFP/CFP发射比在整个细胞上取 平均值，并将时间-10 min作为标准(Salubrinal处理前10min)。(bar＝10μm)。(C)eIF2α siRNA对eIF2α蛋白水平的 部分沉默，加入20μM Salubrinal对Rac1活性的作用。NC＝用非 特异性对照siRNA处理组。 图23 Rac1 siRNA对TRAP和组织蛋白酶K表达的作用。(A)Rac1 siRNA对Rac1蛋白 水平的部分沉默， 以及NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的蛋白表达。NC＝用非特异性对照 siRNA处理。(B)部分沉默Rac1 后的NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的相对mRNA水平。Rac1 siRNA降低了TRAP和组织蛋白酶K的表 达，但NFATc1表达保持不变。 图24 Salubrinal对破骨细胞的影响。(A)成熟破骨细胞的覆盖面积。Salubrinal 抑制OVX诱导的破骨细 胞区域的增加。(B)破骨细胞的迁移试验。Salubrinal给药减少了 OVX诱导的破骨细胞迁移的增加。 (C)破骨细胞的粘附测定。Salubrinal减少了OVX诱导的 破骨细胞粘附增加(n＝6)。 图25 Salubrinal体外给药对破骨细胞活性的影响。(A)将Salubrinal以3个剂量 (1，2和5μM)加入 从OVX小鼠分离的骨髓来源的细胞，处理0-6天或4-6天。右侧的四对图像 显示TRAP染色的代表性破 骨细胞。(Bar＝200μm)。上图：0-6天体外给药Salubrinal的效 果，实验重复三次。每孔计数5个视 野。下图：4-6天体外Salubrinal给药的影响。(B)破骨细 胞的迁移。(C)破骨细胞的粘附(n＝6)。 图26 Salubrinal体内给药对破骨细胞的影响。(A)TRAP染色。股骨远端生长盘近 侧骨小梁的TRAP阳 性细胞为红色，用红色箭头表示。(B)RANKL，组织蛋白酶K和NFATc1的免 疫印迹分析代表性图像。 实验重复三次(n＝9)。 图27 Salubrinal改善OVX引起的骨丢失表征。(A)卵巢去势和给药Salubrinal对 体重，BMD和BMC的 影响。(A)Salubrinal抑制OVX诱导的体重增加。(B)Salubrinal给药抑制 OVX诱导的腰椎、股骨和 胫骨中BMD和BMC的减少。(C)μCT代表性图像。纵向(顶部)和横向 (底部)横切面股骨重建图 像。(D-G)在使用Salubrinal治疗4周后，Salubrinal改善OVX诱 导的股骨BV/TV减少(D)、股骨小 梁数(Tb.N)(E)和股骨小梁厚度(Tb.Th)的减少(F)，并抑 制骨小梁分离度(Tb.Sp)的增加(G)。 (H)股骨远端H&E染色。黑色箭头所指为骨小梁。(I)钙 黄绿素标记的皮质骨，MAR为矿物沉积率 (n＝16)。
