技术摘要：
本发明公开了一种基于纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，包括金属纳米探针的制备、特异性杂交反应以及基于ICP‑MS的含量检测三个操作步骤。同时检测方法包括将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微孔中，孵育清洗后获得  全部
背景技术：
由于miRNAs的异常表达水平往往早于肿瘤的发生，因此，miRNA在预测肿瘤发生状 态方面具有很大的潜力。宫颈癌(CC)是严重危害女性健康的恶性肿瘤，随着临床医学对疾 病早期诊断的需求越来越高，与宫颈癌相关miRNAs标志物的寻找及其定量检测越来越受到 高度关注。 近年来，研究发现多种miRNA的异常表达与宫颈癌的发病机制密切相关。例如：Li 等人阐明了过表达的miR-486-5p激活致癌的PI3K/Akt通道和抑制PTEN的表达来刺激致细 胞增殖、迁移和侵袭，表明了miR-486-5p可以作为一种新的生物标志物用于宫颈癌的诊断 和治疗。 王慧军、李小兰等人发现宫颈癌患者的病理组织中miRNA-221表达水平升高，并发 现这一现象与与宫颈癌临床病理因素的相关性，证实了miRNA-221基因对宫颈癌发病发展 起着重要影响。 王慧军、李小兰检测了31例宫颈癌(Cervical  cancer，CC)标本及配对正常组织标 本中micRNA-221的表达，分析了micRNA-221表达水平与患者临床特征之间的关系，为 micRNA-221后续功能研究奠定基础。 上述检测所采用的具体方法为：提取31例手术切除的宫颈癌及癌旁正常组织标本 中的总RNA，反转录获得cDNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测micRNA-221的表达水平，统 计分析其表达水平与患者临床病理特征之间的关系。结果31例组织标本中28例(90.3％)宫 颈癌组织micRNA-22121表达水平上调(P<0 .05)，但上调和患者年龄、性别、肿瘤的TNM和 FIGO分期等无明显相关性(P>0.05)。结论micRNA-221在宫颈癌组织中表达明显上调，提示 其与宫颈癌发生有一定关系。 周玉飞、岳青芬探讨了miRNA-21、miRNA-34a在宫颈癌、CIN、正常组织中的表达差 异及对宫颈癌早期诊断的价值。周玉飞、岳青芬所采用的具体方法为：选取子宫肌瘤患者、 CIN患者、宫颈癌患者为研究对象，检测病理组织、正常组织及血清中miRNA-21、miRNA-34a 的表达水平，统计分析二者表达的临床意义。 检测结果为：(1)与其他患者相比，宫颈癌患者组织及血清中miRNA-21表达水平显 著较高，miRNA-34a水平显著较低(P<0 .01)；(2)临床分期、是否存在淋巴结转移是影响 miRNA-21表达水平的独立性危险因素。但miRNA-34a表达水平对宫颈癌患者临床病理参数 无明显影响；(3)ROC曲线显示，miRNA-21、miRNA-34a对宫颈癌诊断的敏感性为87 .9％、 92.8％，特异性为78.8％、64.8％。结论miRNA-21、miRNA-34a参与了宫颈癌的发生发展过 程，且二者对宫颈癌的诊断有一定的预测效能。 4 CN 111575383 A 说　明　书 2/7 页 经研究发现宫颈癌患者血清中miR-21、miR-221和miR-486-5p的表达显著增加，而 且分期越晚表达越高，且基因的异常水平往往早于肿瘤的形成。因此，如果能够实现这三种 miRNAs的联合定量检测，有望实现宫颈癌的早期诊断。 目前，miRNA检测的技术主要有基于杂交、扩增和测序原理的三大技术。但这三种 技术都存在着不可规避的缺点，比如：基于扩增原理的技术主要有RT-PCR扩增法、滚环扩增 技术和指数扩增技术，在临床实验室中相对被广泛使用的是基于扩增原理的PCR技术，该技 术相对成熟且成本较低，但不能对miRNA进行精确测定。基于测序原理的大规模测序技术虽 然能够快速且高灵敏度地检测miRNA，但其对数据库较大和复杂的样本进行测序时，需耗费 较高的成本。基于杂交原理的印迹杂交技术一直被视为miRNA检测和鉴定的标准方法，但检 测费时、样品用量大、灵敏度低限制了该技术广泛使用；微阵列芯片检测，能实现miRNA快速 高通量检测，但该方法具有灵敏度低、特异性不好的缺点。因此，开发一种简单、灵敏度高并 且能同时进行多组分miRNA检测的方法是很有必要的。 利用ICP-MS能够对多种元素同时分析且灵敏度高的特性和金属在生物体中很少 存在而基体干扰小的优点，通过多种金属纳米颗粒标记报告探针，金属纳米颗粒标记报告 探针、目标miRNAs和捕获探针通过特异性识别固载到微孔板上，最终ICP-MS对标记探针金 属同位素的质荷比进行分析，从而达到对多种miRNA的同时定量检测。ICP-MS对标记元素的 选择不需要元素有放射、光学、磁学、电学等特殊的性质，因此选择的范围比较大。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测 的方法。 为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种基于金属纳米探针的多种宫颈 癌miRNA标志物同时检测的方法，包括以下步骤： 步骤(1)金属纳米探针的制备 将三种不同的金属纳米粒子溶胶分别加入ssDNA-486-5p报告探针溶液、ssDNA- 221报告探针溶液以及ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置若干小时，静置后每隔一段时 间加入NaCl溶液处理，然后离心去除上清液，并使用磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于 磷酸盐缓冲液中，得到三种金属纳米探针，并在低温下保存备用； 步骤(2)特异性杂交反应 将链霉亲和素微孔板用杂交缓冲液预洗若干次，然后将生物素标记的捕获探针 ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和杂交缓冲液加入到链 霉亲和素微孔板中，室温下震荡孵育；孵育完毕后吸出微孔板孔内液体，清洗缓冲液洗去未 结合的捕获探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载；获得已经固载 有捕获探针的微孔板； 将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微 孔中，经过孵育后冷却至室温，并在室温下孵育一定时间，然后吸出孔内液体，用清洗缓冲 液清洗后使用超纯水清洗，除去多余的金属纳米探针；获得固载有金属纳米粒子的杂交复 合物微孔板； 步骤(3)基于ICP-MS的含量检测 5 CN 111575383 A 说　明　书 3/7 页 在固载有杂交复合物的微孔中加入稀硝酸溶液进行反应，将微孔中的金属纳米粒 子溶解到稀硝酸溶液中，然后将反应溶液转移至离心管中后使用ICP-MS仪器测定金属同位 素的信号强度，该信号强度用于表征三种目标miRNA浓度。 本发明的优化方案之一，步骤(1)中，三种不同的金属纳米粒子分别为纳米银溶 胶、纳米铂溶胶和纳米金溶胶，三种金属纳米探针分别为AgNPs标记的ssDNA-486-5p报告探 针；PtNPs标记的ssDNA-221报告探针；AuNPs标记的ssDNA-21报告探针。 本发明的优化方案之一，步骤(1)的具体方法为： 取2ml纳米银溶胶、2ml纳米铂溶胶、2ml纳米金溶胶分别加入体积为40μL、含量为 100mM/L  ssDNA-486-5p报告探针溶液，体积为40μL、含量为100mM/L  ssDNA-221报告探针溶 液以及体积为40μL、含量为100mM/L的ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置24h，之后24h 内每隔8h加入120μL、2M/L的NaCl溶液处理，然后使用离心机在10000rpm转速下离心20min， 去除上清液，并使用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于2mL的磷酸盐缓冲液PBS 中，得到三种金属纳米探针，并在低温4℃下保存备用。 本发明的优化方案之一，步骤(2)的杂交缓冲液中氯化钠的含量为750mM/L，柠檬 酸钠的含量为75mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2；清洗缓冲液中氯化钠的含量为 300mM/L，柠檬酸钠的含量为30mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2。 本发明的优化方案之一，步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为： 使用杂交缓冲液清洗链霉亲和素微孔板2-3次，每次每孔使用300μL；然后将总体 积为10μL、含量为5μM的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的 混合溶液和90μL的杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温震荡孵育1h，然后吸出微 孔板孔内液体，用清洗缓冲液清洗2～3次，每孔300μL，去除未结合的捕获探针，链霉亲和素 和捕获探针的生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载，获得已经固载有捕获探针的微孔 板。 本发明的优化方案之一，步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为： 将5μL三种金属纳米探针和100μL三种目标miRNA的混合溶液分别加入到经过处理 的已经固载有捕获探针的微孔板中，在60℃下孵育半小时，在2～3h内缓慢降至室温，然吸 出孔内液体，用清洗缓冲液清洗微孔2～3次，超纯水洗孔1次，除去多余的金属纳米探针，获 得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板。 本发明的优化方案之一，步骤(3)基于ICP-MS的含量检测的具体方法为： 在固载有杂交复合物的微孔中加入2％稀硝酸溶液进行反应，每孔中加入100uL， 在75℃反应20分钟，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中；然后将反应溶液转移 至离心管中后用2％HNO3硝酸溶液稀释至2mL，使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强 度，该信号强度用于推算出三种目标miRNA浓度。 本发明的优化方案之一，本发明设计了目标标记物的寡核苷酸序列： 目标miRNA-486-5p的序列为：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG； 目标miRNA-221的序列为：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUU； 目标miRNA-21的序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。 本发明的优化方案之一， 捕获探针ssDNA-486-5p的序列为TCAGTACAGGATTTTTTTTTT-biotin； 6 CN 111575383 A 说　明　书 4/7 页 捕获探针ssDNA-221的序列为ACAATGTAGCTTTTTTTTTTT-biotin； 捕获探针ssDNA-21的序列为CTGATAAGCTATTTTTTTTTT-biotin。 本发明的优化方案之一， ssDNA-486-5p报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT  TTT  TTT  TTC  TCG  GGG  CAG  C； ssDNA-221报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT  TTTTTT  TTA  ACC  CAG  CAG； ssDNA-21报告探针序列为HS-(CH2)6-TTTTTTTTTTTCAACATCAGT。 综上所述，本发明具有以下优点： 1、本发明通过金属纳米粒子标记报告探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实 现捕获探针的固载；通过加入稀硝酸溶解金属纳米粒子，得到含有金属离子的硝酸溶液，通 过ICP-MS进行测定，金属同位素的信号强度与目标miRNAs浓度的对数呈线性关系，本发明 的方法具有较高的灵敏度和特异性，能够用于多种miRNA的同时快速、高灵敏检测，从而实 现宫颈癌早期诊断。 2、本发明通过ICP-MS能够同时检测多个金属元素，进而能够对多个目标miRNA进 行联合检测，相对于现有技术中只能够检测一种miRNA具有更高的检测灵敏度和准确度。生 物体中几乎不存在金属同位素银、铂和金，因此检测中干扰小；ICP-MS对金属同位素进行检 测，也不需要元素有特殊的性质，不需要放射性的，光学的，电学的，电化学的和磁性的特殊 性质，可操作性更高，更容易实施。 附图说明 图1为本发明特异性杂交反应和含量检测的原理图； 图2为本发明实施例4的miRNA-486-5p的标准曲线； 图3为本发明实施例4的miRNA-221的标准曲线； 图4为本发明实施例4的miRNA-21的标准曲线； 图5为本发明对比实验实施例5的实验结果，其中1为目标miRNA、2为对照组A、3为 对照组B，4为对照组C；所有探针浓度为10pM。