技术摘要：
本发明属于生物技术与发酵工程领域，提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用，本发明将透明颤菌血红蛋白VHb与枯草芽胞杆菌中YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌中淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb蛋白表达框P43‑SPywbN‑vhb‑Tam 全部
背景技术：
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是在细菌中发现的第一种血 红蛋白，其来源于一种革兰氏阴性菌——透明颤菌。自然状态下的VHb以同型二聚体形式存 在，两个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋(A,B,E,F,G,H)，相对分子量为15775，且各 含有一分子b型血红素。低氧条件下，VHb可以与氧结合，发生构象变化，又能够与氧解离，将 氧传递给呼吸链，调节呼吸链末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多种宿主细胞(大肠杆菌、 假单胞菌、烟草、水稻、斑马鱼等)中成功表达，用于改善动植物细胞特性、改善细菌在高耗 氧或氧气受限的高密度发酵中的生长情况。 虽然已有人将透明颤菌血红蛋白成功异源表达在芽胞杆菌中(熊欢等，微生物学 通报，2008,11:1703-1707；Cai et al.,Biotechnol Bioeng,2018,115:2541-2553)，但前 人均是将血红蛋白直接在芽胞杆菌中表达，但是如何构建更加高效且具有广谱性的VHb表 达框一直亟待研究。 枯草芽胞杆菌中未知功能的蛋白质YwbN是按照Tat分泌途径分泌的蛋白质，其含 有双精氨酸信号肽，N端含有双精氨酸(RR/KR)二级结构。然而，目前该YwbN蛋白功能未知。 在之前的研究中，人们通过对信号肽的筛选，可以提高目标蛋白的表达水平。然而，相关的 文献研究同时提出，对于不同的目标蛋白，其穿膜肽的筛选并不具有普适性，即人们需要根 据特定的目标蛋白来选择合适的穿膜肽。然而，暂无穿膜肽YwbN会影响目的蛋白合成的文 献报道。 此外，虽然有研究将血红蛋白与Tat型穿膜肽进行耦联表达，提高了盐单胞菌中氧 气供给效率和PHA产量(Ouyang et al.,Metab Eng ,2018,45:20-31)。然而，文章并没有列 出具体的穿膜肽种类。此外，盐单胞菌与芽胞杆菌基因组信息无相似性，生理形态也差别较 大。因此，无法根据前人结果进行芽胞杆菌中透明颤菌血红蛋白的高效表达及基于透明颤 菌血红蛋白高效表达的代谢产物的高效合成。 申请人发现，将透明颤菌血红蛋白VHb与穿膜肽耦联表达，可以提高细胞的氧气传 递效率，进而有利于代谢产物合成。本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中 未知功能蛋白YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终 止子TamyL相连，组成VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL。并将该表达框应用于三种芽胞杆 菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)中，分别提高了聚γ-谷氨 酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量。本发明的研究结果将对工业生产中透明颤菌血红蛋白VHb 在芽胞杆菌中的高效表达和广泛应用提供指导。 3 CN 111549050 A 说 明 书 2/10 页
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述 表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 本发明的另一个目的在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框的 应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施： 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 透明颤菌血红蛋白表达框在提高芽胞杆菌发酵效率中的应用，包括将含有透明颤 菌血红蛋白表达框的表达载体，导入芽胞杆菌中，将该转基因菌株进行常规发酵生产。 所述的透明颤菌血红蛋白表达框的序列为SEQ ID NO.1所示； 所述的表达载体为适用于芽胞杆菌的表达载体； 以上所述的应用中，优选的，所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆 菌、地衣芽胞杆菌。 以上所述的应用中，优选的，所述的枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168，所述的解 淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌LX-12、所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高枯草芽胞杆菌168发酵生 产聚γ-谷氨酸中的应用； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高解淀粉芽胞杆菌LX-12发 酵生产伊枯草菌素A中的应用； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高地衣芽胞杆菌DW2发酵生 产杆菌肽中的应用； 以上所述的应用中，优选的，所述的表达载体为pHY300PLK载体。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中未知功能蛋白YwbN的信号 肽S PywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb 表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL，含有该表达框的三种芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉 芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)的聚γ-谷氨酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量均有不同 程度的提高。本发明结果表明，构建VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL是一种提高芽胞杆菌 中透明颤菌血红蛋白表达效率的方法，或对更广泛的芽胞杆菌的工业生产有借鉴意义。
本发明属于生物技术与发酵工程领域，提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用，本发明将透明颤菌血红蛋白VHb与枯草芽胞杆菌中YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌中淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb蛋白表达框P43‑SPywbN‑vhb‑Tam 全部
背景技术：
透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是在细菌中发现的第一种血 红蛋白，其来源于一种革兰氏阴性菌——透明颤菌。自然状态下的VHb以同型二聚体形式存 在，两个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋(A,B,E,F,G,H)，相对分子量为15775，且各 含有一分子b型血红素。低氧条件下，VHb可以与氧结合，发生构象变化，又能够与氧解离，将 氧传递给呼吸链，调节呼吸链末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多种宿主细胞(大肠杆菌、 假单胞菌、烟草、水稻、斑马鱼等)中成功表达，用于改善动植物细胞特性、改善细菌在高耗 氧或氧气受限的高密度发酵中的生长情况。 虽然已有人将透明颤菌血红蛋白成功异源表达在芽胞杆菌中(熊欢等，微生物学 通报，2008,11:1703-1707；Cai et al.,Biotechnol Bioeng,2018,115:2541-2553)，但前 人均是将血红蛋白直接在芽胞杆菌中表达，但是如何构建更加高效且具有广谱性的VHb表 达框一直亟待研究。 枯草芽胞杆菌中未知功能的蛋白质YwbN是按照Tat分泌途径分泌的蛋白质，其含 有双精氨酸信号肽，N端含有双精氨酸(RR/KR)二级结构。然而，目前该YwbN蛋白功能未知。 在之前的研究中，人们通过对信号肽的筛选，可以提高目标蛋白的表达水平。然而，相关的 文献研究同时提出，对于不同的目标蛋白，其穿膜肽的筛选并不具有普适性，即人们需要根 据特定的目标蛋白来选择合适的穿膜肽。然而，暂无穿膜肽YwbN会影响目的蛋白合成的文 献报道。 此外，虽然有研究将血红蛋白与Tat型穿膜肽进行耦联表达，提高了盐单胞菌中氧 气供给效率和PHA产量(Ouyang et al.,Metab Eng ,2018,45:20-31)。然而，文章并没有列 出具体的穿膜肽种类。此外，盐单胞菌与芽胞杆菌基因组信息无相似性，生理形态也差别较 大。因此，无法根据前人结果进行芽胞杆菌中透明颤菌血红蛋白的高效表达及基于透明颤 菌血红蛋白高效表达的代谢产物的高效合成。 申请人发现，将透明颤菌血红蛋白VHb与穿膜肽耦联表达，可以提高细胞的氧气传 递效率，进而有利于代谢产物合成。本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中 未知功能蛋白YwbN的信号肽SPywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终 止子TamyL相连，组成VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL。并将该表达框应用于三种芽胞杆 菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)中，分别提高了聚γ-谷氨 酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量。本发明的研究结果将对工业生产中透明颤菌血红蛋白VHb 在芽胞杆菌中的高效表达和广泛应用提供指导。 3 CN 111549050 A 说 明 书 2/10 页
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述 表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 本发明的另一个目的在于提供了适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框的 应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施： 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 透明颤菌血红蛋白表达框在提高芽胞杆菌发酵效率中的应用，包括将含有透明颤 菌血红蛋白表达框的表达载体，导入芽胞杆菌中，将该转基因菌株进行常规发酵生产。 所述的透明颤菌血红蛋白表达框的序列为SEQ ID NO.1所示； 所述的表达载体为适用于芽胞杆菌的表达载体； 以上所述的应用中，优选的，所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆 菌、地衣芽胞杆菌。 以上所述的应用中，优选的，所述的枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌168，所述的解 淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌LX-12、所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高枯草芽胞杆菌168发酵生 产聚γ-谷氨酸中的应用； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高解淀粉芽胞杆菌LX-12发 酵生产伊枯草菌素A中的应用； 以上所述的应用，包括透明颤菌血红蛋白表达框在提高地衣芽胞杆菌DW2发酵生 产杆菌肽中的应用； 以上所述的应用中，优选的，所述的表达载体为pHY300PLK载体。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 本发明将透明颤菌血红蛋白基因vhb与枯草芽胞杆菌中未知功能蛋白YwbN的信号 肽S PywbN以及枯草芽胞杆菌启动子P43、地衣芽胞杆菌淀粉酶终止子TamyL相连，组成VHb 表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL，含有该表达框的三种芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌168、解淀粉 芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2)的聚γ-谷氨酸、伊枯草菌素A、杆菌肽的产量均有不同 程度的提高。本发明结果表明，构建VHb表达框P43-SPywbN-vhb-TamyL是一种提高芽胞杆菌 中透明颤菌血红蛋白表达效率的方法，或对更广泛的芽胞杆菌的工业生产有借鉴意义。
