技术摘要：
本发明公开了黑茶提取物和p38抑制剂在协同治疗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。本发明抑制剂组合能够有效地协同抑制肿瘤(尤其是胰腺癌)的生长，可 全部
背景技术：
天然膳食制剂由于其疗效好，副作用少而被越来越多地应用于科学研究和临床实 践中。中国茶叶，尤其是绿茶，被广泛报道为一种抗癌物质(Zhang ,D. and M.Al-Hendy,et al .(2010) ."Green tea extract inhibits proliferation of uterine leiomyoma cells in vitro and in nude mice ." American Journal of Obstetrics and Gynecology 202(3):289.e1-289.e9.)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)则是其中最有 效的成分(Roberts ,B.E .and M .L .Duennwald ,et al .(2009) ."A synergistic small- molecule combination directly eradicates diverse prion strain structures ." Nature Chemical Biology 5(12):936-946；Lecumberri,E.and Y.M. Dupertuis,et al. (2013) ."Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate(EGCG)as adjuvant in cancer therapy." Clinical Nutrition 32(6):894-903)。 肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。癌症相关基因的异常 可以引起肿瘤基因组稳定性丧失，进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为，如逃避凋亡、 无限复制的潜能、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等。 目前，外科手术、放疗、化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。外科手术和放射治疗是 局部治疗的方法，药物治疗属于全身效应的方法，更多地考虑到了恶性肿瘤能够扩散和转 移的特质。 胰腺癌是全球第七大癌症死亡原因，这一疾病通常在癌症晚期被诊断出来，并且 其五年生存率极低(大约3％)。 目前，吉西他滨是治疗胰腺癌的主要化疗药物，然而，临床治疗效果不佳以及耐药 性的频繁出现，促使人们需要开发更有效的治疗方案。 因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗肿瘤，尤其是胰腺癌的治疗方法和药物。
技术实现要素：
本发明提供了一种黑茶提取物与p38抑制剂在协同治疗肿瘤的用途。 本发明第一方面，提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取 物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较 佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水溶性提取物、脂溶性的提取物、或其 组合。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提 3 CN 111588856 A 说 明 书 2/13 页 取物、酯提取物、或其组合。 在另一优选例中，所述的醇包括C1－C6烷基醇(如乙醇)。 在另一优选例中，所述的酯包括：乙酸乙酯。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物含有选自下组的组分：儿茶素类、黄酮类、有 机酸类、或其组合。 在另一优选例中，所述的p38来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大 鼠)或人。 在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、 乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、或其组合。 在另一优选例中，所述的肿瘤包括：胰腺癌。 在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括p38的抗体、p38核酸的反义RNA、 siRNA、 shRNA以及小分子抑制剂。 在另一优选例中，所述的小分子抑制剂选自下组：EO-1428、PD169316、 SB202190、 SB203580、SB239063、SB281832、VX-702、VX-745、ZM336372、RPR 200765A、或其组合。 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。 在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇。 在另一优选例中，黑茶提取物与p38抑制剂的质量比为100:1至1:10。 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：口服制剂(如片剂、胶囊)、栓 剂、和静脉注射液。 在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括黑茶提取 物、p38抑制剂和药学上可接受的载体。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较 佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。 本发明第三方面，提供了一种抑制剂组合，所述组合由黑茶提取物和p38 抑制剂 构成。 在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括阻断通过p38MAP激酶途径的信号传导的 任何物质。 在本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法， 包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入第二方面所述的药物组合物和/ 或本发明第三方面 所述抑制剂组合，从而协同抑制肿瘤细胞生长。 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：胰腺癌细胞、肺癌细胞、肠癌细胞、胃 癌细胞、肝癌细胞、胆囊癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、或 其组合。 在另一优选例中，所述方法包括：将肿瘤细胞(每孔2000-4000个细胞，优选每孔 2500-3500个细胞，更优选每孔3000个细胞)和黑茶提取物及p38抑制剂一起混合培养0-48 小时。 在另一优选例中，混合培养液中黑茶提取物的终浓度为71.79μg/ml。 在另一优选例中，混合培养液中p38抑制剂的终浓度为10μM。 4 CN 111588856 A 说 明 书 3/13 页 本发明第五方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，向所需对象施用安全 有效量的本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述抑制剂组合。 本发明第六方面，提供了一种抗肿瘤细胞生长的黑茶提取物，所述的黑茶提取物 包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提取物、酯提取物、或其组合。 应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此 不再一一累述。 附图说明 图1显示了黑茶乙酸乙酯提取物抑制胰腺癌细胞的生长。各图如下: (A)显示了一种黑茶乙酸乙酯提取物的制备流程，其中，黑茶用10倍体积水煎煮提 取3次，分别提取2小时、1.5小时和1小时。合并水提取液并减压浓缩后，依次用石油醚、乙酸 乙酯和正丁醇溶剂萃取，最后浓缩并干燥； (B)用不同品种、不同浓度的黑茶乙酸乙酯萃取物或者正丁醇萃取物处理 PANC-1 或者SW1990细胞48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)， 在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P<0.01(Student 氏t测验)；(Control:对照)。 (C)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者 SW1990细 胞的免疫印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。 图2显示了乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物是阻滞癌细胞生长最有效的组分。各图 如下: (A)将天尖黑茶乙酸乙酯萃取物溶解在95％乙醇中，按质量比1：2加入HP-20 大孔 树脂拌样。干燥后上色谱柱，静态吸附24小时。接下来用蒸馏水，30％乙醇，50％乙醇和95％ 乙醇(3倍柱体积)依次洗脱； (B)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的四种洗脱物处理PANC-1或者SW1990细胞 48小 时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表 示P<0.05,**表示P<0.01(Student氏t测验)； (C)用天尖黑茶水洗脱物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者SW1990细胞的免疫 印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。 图3显示了水洗脱物和P38抑制剂协同作用阻滞胰腺癌细胞生长。各图如下： (A)用P38抑制剂SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天 尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度。免疫印迹分析实验使 用指明的抗体； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用所示剂量的天尖 黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物处理48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值± 标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05 , **表示P<0.01(Student氏t测 验)； (C)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙 酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度，并检测ROS的产生。以上数值表示平 均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P <0.05,**表示P<0.01(Student氏 5 CN 111588856 A 说 明 书 4/13 页 t测验)。 各图中，SB表示P38抑制剂SB203580。 图4显示了水洗脱物导致与细胞生长阻滞相关的基因表达模式改变。各图如下： (A)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理SW1990细胞 12小 时，27496个探针集的层次聚类分析表明了处理组和对照组的基因表达量； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物 中的水洗脱物的IC50浓度处理12小时，通过实时荧光定量PCR分析两组之间ID1(左图)和 PYCARD(右图)的相对mRNA表达水平。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定 的组别之间*表示P<0.05,**表示P <0.01(Student氏t测验)。 图5显示了ID1过表达对水洗脱物导致的癌细胞生长受抑有显著的回复效应。各图 如下： (A)将过表达的ID1质粒转染到SW1990细胞株中，使用相应的抗体进行免疫印迹分 析实验； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理过表达ID1和未过表达ID1的SW1990 细胞 后，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的水洗脱物的在所示剂量下处理48小时，并进行CCK8实 验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示 P<0.01(Student氏t测验)。 图6显示了对天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的LC－MS/MS分析结果。
本发明公开了黑茶提取物和p38抑制剂在协同治疗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。本发明抑制剂组合能够有效地协同抑制肿瘤(尤其是胰腺癌)的生长，可 全部
背景技术：
天然膳食制剂由于其疗效好，副作用少而被越来越多地应用于科学研究和临床实 践中。中国茶叶，尤其是绿茶，被广泛报道为一种抗癌物质(Zhang ,D. and M.Al-Hendy,et al .(2010) ."Green tea extract inhibits proliferation of uterine leiomyoma cells in vitro and in nude mice ." American Journal of Obstetrics and Gynecology 202(3):289.e1-289.e9.)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)则是其中最有 效的成分(Roberts ,B.E .and M .L .Duennwald ,et al .(2009) ."A synergistic small- molecule combination directly eradicates diverse prion strain structures ." Nature Chemical Biology 5(12):936-946；Lecumberri,E.and Y.M. Dupertuis,et al. (2013) ."Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate(EGCG)as adjuvant in cancer therapy." Clinical Nutrition 32(6):894-903)。 肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。癌症相关基因的异常 可以引起肿瘤基因组稳定性丧失，进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为，如逃避凋亡、 无限复制的潜能、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等。 目前，外科手术、放疗、化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。外科手术和放射治疗是 局部治疗的方法，药物治疗属于全身效应的方法，更多地考虑到了恶性肿瘤能够扩散和转 移的特质。 胰腺癌是全球第七大癌症死亡原因，这一疾病通常在癌症晚期被诊断出来，并且 其五年生存率极低(大约3％)。 目前，吉西他滨是治疗胰腺癌的主要化疗药物，然而，临床治疗效果不佳以及耐药 性的频繁出现，促使人们需要开发更有效的治疗方案。 因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗肿瘤，尤其是胰腺癌的治疗方法和药物。
技术实现要素：
本发明提供了一种黑茶提取物与p38抑制剂在协同治疗肿瘤的用途。 本发明第一方面，提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取 物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较 佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水溶性提取物、脂溶性的提取物、或其 组合。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提 3 CN 111588856 A 说 明 书 2/13 页 取物、酯提取物、或其组合。 在另一优选例中，所述的醇包括C1－C6烷基醇(如乙醇)。 在另一优选例中，所述的酯包括：乙酸乙酯。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物含有选自下组的组分：儿茶素类、黄酮类、有 机酸类、或其组合。 在另一优选例中，所述的p38来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大 鼠)或人。 在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、 乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、或其组合。 在另一优选例中，所述的肿瘤包括：胰腺癌。 在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括p38的抗体、p38核酸的反义RNA、 siRNA、 shRNA以及小分子抑制剂。 在另一优选例中，所述的小分子抑制剂选自下组：EO-1428、PD169316、 SB202190、 SB203580、SB239063、SB281832、VX-702、VX-745、ZM336372、RPR 200765A、或其组合。 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。 在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇。 在另一优选例中，黑茶提取物与p38抑制剂的质量比为100:1至1:10。 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：口服制剂(如片剂、胶囊)、栓 剂、和静脉注射液。 在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括黑茶提取 物、p38抑制剂和药学上可接受的载体。 在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较 佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。 本发明第三方面，提供了一种抑制剂组合，所述组合由黑茶提取物和p38 抑制剂 构成。 在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括阻断通过p38MAP激酶途径的信号传导的 任何物质。 在本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法， 包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入第二方面所述的药物组合物和/ 或本发明第三方面 所述抑制剂组合，从而协同抑制肿瘤细胞生长。 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：胰腺癌细胞、肺癌细胞、肠癌细胞、胃 癌细胞、肝癌细胞、胆囊癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、或 其组合。 在另一优选例中，所述方法包括：将肿瘤细胞(每孔2000-4000个细胞，优选每孔 2500-3500个细胞，更优选每孔3000个细胞)和黑茶提取物及p38抑制剂一起混合培养0-48 小时。 在另一优选例中，混合培养液中黑茶提取物的终浓度为71.79μg/ml。 在另一优选例中，混合培养液中p38抑制剂的终浓度为10μM。 4 CN 111588856 A 说 明 书 3/13 页 本发明第五方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，向所需对象施用安全 有效量的本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述抑制剂组合。 本发明第六方面，提供了一种抗肿瘤细胞生长的黑茶提取物，所述的黑茶提取物 包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提取物、酯提取物、或其组合。 应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此 不再一一累述。 附图说明 图1显示了黑茶乙酸乙酯提取物抑制胰腺癌细胞的生长。各图如下: (A)显示了一种黑茶乙酸乙酯提取物的制备流程，其中，黑茶用10倍体积水煎煮提 取3次，分别提取2小时、1.5小时和1小时。合并水提取液并减压浓缩后，依次用石油醚、乙酸 乙酯和正丁醇溶剂萃取，最后浓缩并干燥； (B)用不同品种、不同浓度的黑茶乙酸乙酯萃取物或者正丁醇萃取物处理 PANC-1 或者SW1990细胞48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)， 在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P<0.01(Student 氏t测验)；(Control:对照)。 (C)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者 SW1990细 胞的免疫印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。 图2显示了乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物是阻滞癌细胞生长最有效的组分。各图 如下: (A)将天尖黑茶乙酸乙酯萃取物溶解在95％乙醇中，按质量比1：2加入HP-20 大孔 树脂拌样。干燥后上色谱柱，静态吸附24小时。接下来用蒸馏水，30％乙醇，50％乙醇和95％ 乙醇(3倍柱体积)依次洗脱； (B)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的四种洗脱物处理PANC-1或者SW1990细胞 48小 时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表 示P<0.05,**表示P<0.01(Student氏t测验)； (C)用天尖黑茶水洗脱物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者SW1990细胞的免疫 印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。 图3显示了水洗脱物和P38抑制剂协同作用阻滞胰腺癌细胞生长。各图如下： (A)用P38抑制剂SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天 尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度。免疫印迹分析实验使 用指明的抗体； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用所示剂量的天尖 黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物处理48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值± 标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05 , **表示P<0.01(Student氏t测 验)； (C)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙 酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度，并检测ROS的产生。以上数值表示平 均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P <0.05,**表示P<0.01(Student氏 5 CN 111588856 A 说 明 书 4/13 页 t测验)。 各图中，SB表示P38抑制剂SB203580。 图4显示了水洗脱物导致与细胞生长阻滞相关的基因表达模式改变。各图如下： (A)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理SW1990细胞 12小 时，27496个探针集的层次聚类分析表明了处理组和对照组的基因表达量； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物 中的水洗脱物的IC50浓度处理12小时，通过实时荧光定量PCR分析两组之间ID1(左图)和 PYCARD(右图)的相对mRNA表达水平。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定 的组别之间*表示P<0.05,**表示P <0.01(Student氏t测验)。 图5显示了ID1过表达对水洗脱物导致的癌细胞生长受抑有显著的回复效应。各图 如下： (A)将过表达的ID1质粒转染到SW1990细胞株中，使用相应的抗体进行免疫印迹分 析实验； (B)SB203580(10μM处理1小时)预处理过表达ID1和未过表达ID1的SW1990 细胞 后，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的水洗脱物的在所示剂量下处理48小时，并进行CCK8实 验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示 P<0.01(Student氏t测验)。 图6显示了对天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的LC－MS/MS分析结果。
