技术摘要：
本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成葡萄糖检 全部
背景技术：
葡萄糖是自然界中最为重要且分布最广的一种单糖，化学式为C6H12O6，是多羟基 醛的一种，是人体内各组织细胞活动所需的物质。血糖是指血液中葡萄糖，尿糖是指尿液中 葡萄糖，人体内的血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在 空腹血糖浓度为3.9-6.0mmol/L，其受饮食、神经系统、激素等影响，当出现不平衡时，会出 现血糖升高或降低，空腹血糖浓度超过6.0mmol/L称为高血糖，血糖浓度低于3.9mmol/L称 为低血糖。 糖尿病是一种常见的内分泌疾病，是由于人体内胰岛素分泌绝对或相对不足以及 机体靶细胞对胰岛素敏感性降低而引起的血中糖、脂肪、蛋白质等一系列代谢紊乱综合征， 其主要特点是高血糖。随着我国人口老龄化趋势以及生活习惯、饮食结构的改变，糖尿病的 发病率明显升高，长期的糖代谢紊乱会引起多器官、多系统的损害，如心、肾、眼、神经等。葡 萄糖是临床生化检验中的重要指标，可以为糖尿病、高血压以及心脑血管系统等疾病的诊 断、治疗用药、病情监测以及疾病预防等方面提供客观依据。因此，坚持定期检测血糖和尿 糖对糖尿病的治疗有极其重要的意义。 目前，血清中葡萄糖的检测方法主要有：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、葡萄糖脱 氢酶法、电极法、干化学法、气相色谱一同位素稀释质谱法以及无创血糖测量法等。尿糖的 检测方式主要包括班氏法检测、费氏法检测、葡萄糖氧化酶试纸法检测、尿液干化学分析仪 检测等。己糖激酶方法多见于自动生化分析仪，但从红细胞中释放出的有机磷酸酯和一些 酶会消耗NADP，使结果产生偏差，并且价格偏高，临床应用受到限制。葡萄糖脱氢酶法会受 到己糖、木糖等其他糖类的干扰而导致测试者血糖值假性偏高。电极法方法简便迅速，标本 用量较少，且特异性、灵敏度、精密度、准确性均较高，但需要专业设备，适合在医院等机构 使用，不适合居家使用。干化学法快速简便，主要用于急诊。班氏法能够了解患者尿液中糖 分类型，但是对病情较低的糖尿病患者无诊断意义，并且需要较长的反应时间，容易受其他 因素的干扰，从而出现漏诊或误诊的现象。尿液干化学分析仪检测法是一种现代化的尿糖 检测方式，该检查方式具有快捷、准确率高等特点，但是该检测方式会受到温度、尿液中过 氧化氢的含量等多方面内的影响，并且该方法的成本较高，无法在基层医院里推广使用。葡 萄糖氧化酶法的基本原理是：β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下，被氧化生成过氧化氢， 在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，此方法操作简便，性能较好，用量少，成 本低，受糖类还原物质的影响小，广泛用于临床，是卫生部推荐的血糖测定的常规方法，但 抗干扰能力稍差，反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将葡萄糖 氧化酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。中国专利 4 CN 111575340 A 说 明 书 2/8 页 CN102199592A【一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法】介绍了一种制备 共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法，以壳聚糖-精氨酸阴离子微球为载体固定 葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶对β-D-葡萄糖进行检测，是对β-D-葡萄糖检测体系进行的有益 尝试和补充，但其制备流程复杂，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外 其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧 化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测葡萄糖的 方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程，同时固定葡萄糖氧化酶和 过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻葡萄糖氧化分解过程中产 生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高葡萄糖氧化酶酶活力。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 首先，本发明提供一种葡萄糖检测试纸及其制备方法。 本发明所提供的葡萄糖检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到： 1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载 葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球， 即检测微单元； 2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固 定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。 上述方法步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通 过包括如下步骤的方法制备得到： (1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫 苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基 琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到 TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与 过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液； (2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄 糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖 氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄 糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。 其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为 6B； 所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均 尺寸大小可为90微米； 所述水具体可为双蒸水； 所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml，具体可为1mL:10mL； 所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的 3倍； 所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液； 5 CN 111575340 A 说 明 书 3/8 页 所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM， 所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液； 所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液； 所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mM Tris- HCl(pH8.0)溶液； 所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中葡萄糖 氧化酶的酶活为100—250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)， 所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢 酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)； 所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。 在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用 缓冲液洗涤，去除多余的TCEP或DTT；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP 或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液中的葡萄糖氧化酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液 中的过氧化氢酶的配比依次可为：200μL：1-1000μg：1-1000μg； 所述反应可为室温下旋转反应，所述反应的时间可为：0.2-3小时，具体可为1小 时； 步骤(2)中，在激活的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶反应 后，还包括将所得体系用缓冲液洗涤，去除多余的葡萄糖氧化酶，得到负载有葡萄糖氧化酶 的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 进一步包括：将负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的过 氧化氢酶反应后的体系缓冲液洗涤，去除多余的过氧化氢酶，得到负载葡萄糖氧化酶和过 氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 上述方法步骤2)中，所述试纸可为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间； 上述方法步骤2)的操作为：将负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球 滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载葡萄糖氧化酶和 过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的中，使负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球 负载到检测试纸里并固定好； 所述负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球以其溶液的形式滴加； 所述溶液通过向负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球中加入PBS制 得，其中巯丙基琼脂糖球与PBS以体积比为1:2。 上述葡萄糖检测试纸在体外葡萄糖检测中的应用也属于本发明的保护范围。 本发明还提供一种体外检测葡萄糖的方法。 所述体外检测葡萄糖的方法，包括如下步骤：将待测葡萄糖样品加入到检测试纸 的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜 色数据与葡萄糖浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测葡萄糖的浓度值。 上述检测方法中，所述无色的显色底物溶液中的溶质可为3,3-二氨基联苯胺和氯 化镍的混合物，溶剂可为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)； 其中3,3-二氨基联苯胺的质量浓度可为0.05％，氯化镍的质量浓度可为0.05％； 6 CN 111575340 A 说 明 书 4/8 页 所述待测葡萄糖样品可为血浆中葡萄糖(血糖)或者尿液中葡萄糖(尿糖)； 加入无色的显色底物溶液后的反应时间可为10分钟； 所述颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式通过如下方法 获得：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶 液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域 的颜色数据，通过图片三原色(R,G,B)构建颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C) 之间的关系式：G/(R G B)＝-6*10-5C 0.3394，R2＝0.9901，即可(如图4所示)；其中，配制已 知浓度的标准葡萄糖溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)； 所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的 标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色 的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条 带，制作成葡萄糖浓度-颜色标准比色卡，即可，其中，配制已知浓度的标准葡萄糖溶液所用 的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)。 所述方法具有以下特征： 1、干燥的巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，膨胀后的体积大约是干燥状态下的3倍，巯丙 基琼脂糖球本身非常稳定，其表面的双硫键也非常稳定，可以较长时间的存放； 2、葡萄糖氧化酶的活性容易受其反应产生的过氧化氢的抑制，从而影响其催化效 率，通过双硫键的化学交联同时固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶可以保持固定化酶的稳定 性和连续操作能力，快速消除葡萄糖氧化酶的产物抑制，保障该酶促反应的顺利进行，有利 于充分发挥多酶体系的协同催化作用，实现高效转化； 3、无色的显色底物DAB能与过氧化氢和过氧化氢酶反应生成蓝褐色沉淀，在球内 发生反应生成沉淀的颗粒尺寸大于巯丙基琼脂糖球的空隙，刚好能够被“锁住”，沉积在巯 丙基琼脂糖球的空隙中，通过反复水洗证实其沉淀不会洗出到溶液中，因此，在检测样本时 不需要对反应微球进行清洗，可有效避免外界环境的干扰。反应产物在巯丙基琼脂糖球中 的聚集，能够使得反应后的颜色更加集中，更容易观察和判断，方便在家中通过肉眼做初步 判断； 4、显色底物的选择非常重要，其直接决定了显色后的颜色变化，进而影响对葡萄 糖浓度的判断，与其他生成有色溶液的显色底物相比，DAB显色后生成了沉淀，而沉淀刚好 能沉积在巯丙基琼脂糖球中，这是本发明的一大亮点，此外，我们在DAB溶液中添加了氯化 镍NiCl2，构建一种增强型的显色溶液，能够使显色后生成的沉淀颜色加深为蓝褐色，更容 易识别观察，如果不添加NiCl2，生成的沉淀是淡黄色，颜色较浅，区分度较差； 5、本发明选择适当孔径的玻璃纤维做反应试纸条，它是一层层叠加的丝状结构， 层与层之间有空隙，巯丙基琼脂糖球刚好能被其中的空隙“卡住”，被固定在试纸条里，作为 检测区域。可以通过均匀滴加的方法使巯丙基琼脂糖球固定在检测试纸里，也可以直接把 试纸放在饱和巯丙基琼脂糖球的混合液(巯丙基琼脂糖球和PBS的体积比为1:2)中，巯丙基 琼脂糖球自动流动到检测试纸的空隙中并被固定住，形成检测区域。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明制备简单，反应条件温和，所需材料易获取，价格便宜可操作性强； 本发明与现有检测技术相比，不需要大型的仪器设备，不需要复杂的流程，可以很 7 CN 111575340 A 说 明 书 5/8 页 方便地在家里检测葡萄糖含量(包括血糖和尿糖)，动态检测葡萄糖含量变化，不必反复跑 医院挂号检查等待结果。 两次巧妙使用“空隙大小”使得颜色变化更加明显。首先利用巯丙基琼脂糖球内部 空隙，使得反应后生成的有颜色的沉淀能够聚集在球里，使颜色加深。其次利用检测试纸条 (玻璃纤维)的层与层之间的空隙，使巯丙基琼脂糖球能够固定在试纸里，形成检测区域，便 于检测操作和观察。 附图说明 图1为本发明制备的葡萄糖检测试纸的示意图； 图2为荧光显微镜下的巯丙基琼脂糖球(标记CY3荧光染料)和检测试纸(玻璃纤 维)； 图3为本发明中的葡萄糖检测比色卡示意图，葡萄糖的浓度依次为500、400、250、 125、62.5、31.25、0(体系中葡萄糖的终浓度)，单位μM。 图4为颜色数据(R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的对应关系，G/(R G B)＝-6*10-5C 0.3394，R2＝0.9901。
本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成葡萄糖检 全部
背景技术：
葡萄糖是自然界中最为重要且分布最广的一种单糖，化学式为C6H12O6，是多羟基 醛的一种，是人体内各组织细胞活动所需的物质。血糖是指血液中葡萄糖，尿糖是指尿液中 葡萄糖，人体内的血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在 空腹血糖浓度为3.9-6.0mmol/L，其受饮食、神经系统、激素等影响，当出现不平衡时，会出 现血糖升高或降低，空腹血糖浓度超过6.0mmol/L称为高血糖，血糖浓度低于3.9mmol/L称 为低血糖。 糖尿病是一种常见的内分泌疾病，是由于人体内胰岛素分泌绝对或相对不足以及 机体靶细胞对胰岛素敏感性降低而引起的血中糖、脂肪、蛋白质等一系列代谢紊乱综合征， 其主要特点是高血糖。随着我国人口老龄化趋势以及生活习惯、饮食结构的改变，糖尿病的 发病率明显升高，长期的糖代谢紊乱会引起多器官、多系统的损害，如心、肾、眼、神经等。葡 萄糖是临床生化检验中的重要指标，可以为糖尿病、高血压以及心脑血管系统等疾病的诊 断、治疗用药、病情监测以及疾病预防等方面提供客观依据。因此，坚持定期检测血糖和尿 糖对糖尿病的治疗有极其重要的意义。 目前，血清中葡萄糖的检测方法主要有：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、葡萄糖脱 氢酶法、电极法、干化学法、气相色谱一同位素稀释质谱法以及无创血糖测量法等。尿糖的 检测方式主要包括班氏法检测、费氏法检测、葡萄糖氧化酶试纸法检测、尿液干化学分析仪 检测等。己糖激酶方法多见于自动生化分析仪，但从红细胞中释放出的有机磷酸酯和一些 酶会消耗NADP，使结果产生偏差，并且价格偏高，临床应用受到限制。葡萄糖脱氢酶法会受 到己糖、木糖等其他糖类的干扰而导致测试者血糖值假性偏高。电极法方法简便迅速，标本 用量较少，且特异性、灵敏度、精密度、准确性均较高，但需要专业设备，适合在医院等机构 使用，不适合居家使用。干化学法快速简便，主要用于急诊。班氏法能够了解患者尿液中糖 分类型，但是对病情较低的糖尿病患者无诊断意义，并且需要较长的反应时间，容易受其他 因素的干扰，从而出现漏诊或误诊的现象。尿液干化学分析仪检测法是一种现代化的尿糖 检测方式，该检查方式具有快捷、准确率高等特点，但是该检测方式会受到温度、尿液中过 氧化氢的含量等多方面内的影响，并且该方法的成本较高，无法在基层医院里推广使用。葡 萄糖氧化酶法的基本原理是：β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下，被氧化生成过氧化氢， 在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，此方法操作简便，性能较好，用量少，成 本低，受糖类还原物质的影响小，广泛用于临床，是卫生部推荐的血糖测定的常规方法，但 抗干扰能力稍差，反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将葡萄糖 氧化酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。中国专利 4 CN 111575340 A 说 明 书 2/8 页 CN102199592A【一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法】介绍了一种制备 共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法，以壳聚糖-精氨酸阴离子微球为载体固定 葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶对β-D-葡萄糖进行检测，是对β-D-葡萄糖检测体系进行的有益 尝试和补充，但其制备流程复杂，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外 其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧 化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测葡萄糖的 方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程，同时固定葡萄糖氧化酶和 过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻葡萄糖氧化分解过程中产 生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高葡萄糖氧化酶酶活力。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 首先，本发明提供一种葡萄糖检测试纸及其制备方法。 本发明所提供的葡萄糖检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到： 1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载 葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球， 即检测微单元； 2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固 定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。 上述方法步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通 过包括如下步骤的方法制备得到： (1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫 苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基 琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到 TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与 过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液； (2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄 糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖 氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄 糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。 其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为 6B； 所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均 尺寸大小可为90微米； 所述水具体可为双蒸水； 所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml，具体可为1mL:10mL； 所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的 3倍； 所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液； 5 CN 111575340 A 说 明 书 3/8 页 所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM， 所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液； 所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液； 所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mM Tris- HCl(pH8.0)溶液； 所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中葡萄糖 氧化酶的酶活为100—250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)， 所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢 酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)； 所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。 在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用 缓冲液洗涤，去除多余的TCEP或DTT；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP 或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液中的葡萄糖氧化酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液 中的过氧化氢酶的配比依次可为：200μL：1-1000μg：1-1000μg； 所述反应可为室温下旋转反应，所述反应的时间可为：0.2-3小时，具体可为1小 时； 步骤(2)中，在激活的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶反应 后，还包括将所得体系用缓冲液洗涤，去除多余的葡萄糖氧化酶，得到负载有葡萄糖氧化酶 的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 进一步包括：将负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的过 氧化氢酶反应后的体系缓冲液洗涤，去除多余的过氧化氢酶，得到负载葡萄糖氧化酶和过 氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)； 上述方法步骤2)中，所述试纸可为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间； 上述方法步骤2)的操作为：将负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球 滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载葡萄糖氧化酶和 过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的中，使负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球 负载到检测试纸里并固定好； 所述负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球以其溶液的形式滴加； 所述溶液通过向负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球中加入PBS制 得，其中巯丙基琼脂糖球与PBS以体积比为1:2。 上述葡萄糖检测试纸在体外葡萄糖检测中的应用也属于本发明的保护范围。 本发明还提供一种体外检测葡萄糖的方法。 所述体外检测葡萄糖的方法，包括如下步骤：将待测葡萄糖样品加入到检测试纸 的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜 色数据与葡萄糖浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测葡萄糖的浓度值。 上述检测方法中，所述无色的显色底物溶液中的溶质可为3,3-二氨基联苯胺和氯 化镍的混合物，溶剂可为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)； 其中3,3-二氨基联苯胺的质量浓度可为0.05％，氯化镍的质量浓度可为0.05％； 6 CN 111575340 A 说 明 书 4/8 页 所述待测葡萄糖样品可为血浆中葡萄糖(血糖)或者尿液中葡萄糖(尿糖)； 加入无色的显色底物溶液后的反应时间可为10分钟； 所述颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式通过如下方法 获得：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶 液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域 的颜色数据，通过图片三原色(R,G,B)构建颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C) 之间的关系式：G/(R G B)＝-6*10-5C 0.3394，R2＝0.9901，即可(如图4所示)；其中，配制已 知浓度的标准葡萄糖溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)； 所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的 标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色 的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条 带，制作成葡萄糖浓度-颜色标准比色卡，即可，其中，配制已知浓度的标准葡萄糖溶液所用 的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)。 所述方法具有以下特征： 1、干燥的巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，膨胀后的体积大约是干燥状态下的3倍，巯丙 基琼脂糖球本身非常稳定，其表面的双硫键也非常稳定，可以较长时间的存放； 2、葡萄糖氧化酶的活性容易受其反应产生的过氧化氢的抑制，从而影响其催化效 率，通过双硫键的化学交联同时固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶可以保持固定化酶的稳定 性和连续操作能力，快速消除葡萄糖氧化酶的产物抑制，保障该酶促反应的顺利进行，有利 于充分发挥多酶体系的协同催化作用，实现高效转化； 3、无色的显色底物DAB能与过氧化氢和过氧化氢酶反应生成蓝褐色沉淀，在球内 发生反应生成沉淀的颗粒尺寸大于巯丙基琼脂糖球的空隙，刚好能够被“锁住”，沉积在巯 丙基琼脂糖球的空隙中，通过反复水洗证实其沉淀不会洗出到溶液中，因此，在检测样本时 不需要对反应微球进行清洗，可有效避免外界环境的干扰。反应产物在巯丙基琼脂糖球中 的聚集，能够使得反应后的颜色更加集中，更容易观察和判断，方便在家中通过肉眼做初步 判断； 4、显色底物的选择非常重要，其直接决定了显色后的颜色变化，进而影响对葡萄 糖浓度的判断，与其他生成有色溶液的显色底物相比，DAB显色后生成了沉淀，而沉淀刚好 能沉积在巯丙基琼脂糖球中，这是本发明的一大亮点，此外，我们在DAB溶液中添加了氯化 镍NiCl2，构建一种增强型的显色溶液，能够使显色后生成的沉淀颜色加深为蓝褐色，更容 易识别观察，如果不添加NiCl2，生成的沉淀是淡黄色，颜色较浅，区分度较差； 5、本发明选择适当孔径的玻璃纤维做反应试纸条，它是一层层叠加的丝状结构， 层与层之间有空隙，巯丙基琼脂糖球刚好能被其中的空隙“卡住”，被固定在试纸条里，作为 检测区域。可以通过均匀滴加的方法使巯丙基琼脂糖球固定在检测试纸里，也可以直接把 试纸放在饱和巯丙基琼脂糖球的混合液(巯丙基琼脂糖球和PBS的体积比为1:2)中，巯丙基 琼脂糖球自动流动到检测试纸的空隙中并被固定住，形成检测区域。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明制备简单，反应条件温和，所需材料易获取，价格便宜可操作性强； 本发明与现有检测技术相比，不需要大型的仪器设备，不需要复杂的流程，可以很 7 CN 111575340 A 说 明 书 5/8 页 方便地在家里检测葡萄糖含量(包括血糖和尿糖)，动态检测葡萄糖含量变化，不必反复跑 医院挂号检查等待结果。 两次巧妙使用“空隙大小”使得颜色变化更加明显。首先利用巯丙基琼脂糖球内部 空隙，使得反应后生成的有颜色的沉淀能够聚集在球里，使颜色加深。其次利用检测试纸条 (玻璃纤维)的层与层之间的空隙，使巯丙基琼脂糖球能够固定在试纸里，形成检测区域，便 于检测操作和观察。 附图说明 图1为本发明制备的葡萄糖检测试纸的示意图； 图2为荧光显微镜下的巯丙基琼脂糖球(标记CY3荧光染料)和检测试纸(玻璃纤 维)； 图3为本发明中的葡萄糖检测比色卡示意图，葡萄糖的浓度依次为500、400、250、 125、62.5、31.25、0(体系中葡萄糖的终浓度)，单位μM。 图4为颜色数据(R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的对应关系，G/(R G B)＝-6*10-5C 0.3394，R2＝0.9901。
