技术摘要：
本发明提供了一种林蛙油多糖组分，所述的林蛙油多糖组分属于糖‑蛋白复合物，其总糖含量为80.87±1.17％、糖醛酸含量为10.19±0.43％、蛋白含量为6.42±0.16％；所述的林蛙油多糖组分属于杂多糖，由甘露糖、氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和岩藻糖构成；所述的林蛙油多糖  全部
背景技术：
活性氧自由基(Reactive  oxygen  species,ROS)对免疫系统的影响存在两面性： 低浓度时通过调控免疫应答与细胞增殖以控制自身反应性T细胞对自身组织、器官及细胞 的攻击；高浓度时则直接侵害活化的T细胞、破坏免疫细胞膜结构，进而导致免疫功能紊乱。 尽管内源性的抗氧化酶及其相关物质能在一定程度上减少过剩ROS对机体的损伤，但面对 氧化应激，这些内源性的抗氧化酶及其物质往往达不到最低的有效浓度。因此，氧化应激状 态下，外源性补充抗氧化剂对自身免疫系统及其功能的修复是十分必要的。 抗氧化是多数天然多糖均具有的活性之一。最近研究证实：抗氧化多糖往往表现 较强的免疫增强作用，如金钱菇菌丝体多糖(Carbohydr.Polym.92(2)(2013)2187-92)、藜 麦多糖(Int.J .Biol .Macromol .99(2017)622-629)、灵芝多糖(Carbohydr.Polym .77(2) (2009)389-393)、石榴多糖(Mol.Med .Rep.5(2)(2012)489-96)等。这不仅进一步证实抗氧 化与免疫增强作用的相关性，也为基于抗氧化活性的免疫调节多糖的制备与分离提供了依 据。 林蛙油(Oviductusranae)，又称哈蟆油，雌性成体林蛙输卵管的干制品，是珍贵的 传统补益类中药材。《中国药典》记载：哈蟆油“补肾益精，养阴润肺”。用于病后体弱，神疲乏 力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。基于传统应用，国家药品监督管理局批准上市的20多种林蛙 油保健食品多以增强机体免疫力、抗疲劳、延缓衰老为保健功能。林蛙油中富含多种对人体 有益的活性成分，如蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂、多糖、维生素、核酸、激素及铁、锰、硒等人 体必需的微量元素。林蛙油中蛋白质含量高达50％以上，是主要的活性成分，其理化性质与 药理作用已得到广泛研究与证实(Oxid.Med.Cell.Longev.2019(2012)4739450)，而林蛙油 中的多糖活性成分却鲜有研究。 郑卫星、杨靖、陈亮等分别报道了酶法辅助提取林蛙油粗多糖的工艺条件及粗多 糖饮料的研制，但未对其活性及功效组分进行研究(吉林农业大学学报,2011,33(4):403- 407；中国生化药物杂志,2008 ,29(1):43-45；《黑龙江畜牧兽医》科技版,2012 ,11 ,129- 131)；杨靖报道了林蛙油粗多糖的提取及抗肿瘤与抗疲劳作用，但未对其功效组分进行分 离与表征(吉林农业大学,2011,硕士学位论文)；专利200910152923.8虽然公开了一种林蛙 油多糖的分离方法，却依然缺少有效的结构表征及活性评价。 综上，目前林蛙油多糖研究不够深入，功效组分的跟踪分离与结构特征及活性评 价有待进一步探索。结合抗氧化与免疫调节作用的相关性，本发明提供一种基于抗氧化活 性导向分离得到的林蛙油免疫调节多糖组分及其产品应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种林蛙油多糖组分及其产品应用。 4 CN 111548429 A 说　明　书 2/7 页 根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种林蛙油多糖组分，所述的林蛙油多 糖组分属于糖-蛋白复合物，该复合物包含80.87±1 .17％的总糖、10.19±0.43％的糖醛 酸、6.42±0.16％的蛋白；所述的林蛙油多糖组分属于杂多糖，由甘露糖、氨基葡萄糖、半乳 糖醛酸、半乳糖和岩藻糖以1:2.28:2.40:3.00:2.23的摩尔比构成；所述的林蛙油多糖组分 属于多分散多糖，其重均分子量(MW)为999.586kDa、数均分子量(MN)为244.366kDa、多分散 指数(MW/MN)为4.09；所述的林蛙油多糖组分属于吡喃糖，连接方式包括α-和/或β-构型的糖 苷键。 所述林蛙油多糖组分的制备方法包括如下步骤： 1)粗多糖的提取 参考杨靖硕士学位论文(林蛙油粗多糖提取条件优化及其药理活性研究，吉林农 业大学，2011)中提及的方法，称取10g林蛙油脱脂粉末，以100:1的液料比在蒸馏水中浸泡 12h后均质，调节pH至6.8，加入0.2％(w/w)的木瓜蛋白酶于37℃孵育2h；沸水浴中灭酶 10min，冷却、离心取上清液，调节pH至7.0，浓缩体积至1/4后加入3倍体积量的95V％乙醇水 溶液，于4℃静置12h；离心收集沉淀，冷冻干燥后得林蛙油粗多糖，得率5.09±0.21％、总糖 含量23.08±1.56％。 2)粗多糖的纯化 采用Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝4:1)脱蛋白3次；除去残留的Sevag试剂后透析3 次；透析液冷冻干燥后得林蛙油纯化多糖，总糖含量55.42±1.21％。 3)多糖组分的分离 称取100mg林蛙油纯化多糖溶于20mL去离子水中，上样至二乙氨基乙基(DEAE)纤 维素-52色谱柱(2.6cm×60cm)；用去离子水、0.1mol/L～0.5mol/L的NaCl溶液依次进行梯 度洗脱，流速1mL/min、每管5mL；苯酚-硫酸法检测波长490nm的吸光度，绘制洗脱曲线；根据 洗脱曲线的指示，选择性收集峰面积最大的主峰所对应的洗脱液，即合并0.3mol/L  NaCl溶 液所对应的洗脱液；用去离子水对洗脱液透析3次；冷冻干燥得所述的林蛙油多糖组分；该 多糖组分含有80.87±1.17％的总糖、10.19±0.43％的糖醛酸、6.42±0.16％的蛋白。 根据本发明的另一个方面，本发明提供了所述林蛙油多糖组分在制备抗氧化与增 强机体免疫力功能产品中的用途；可用于制备片剂、胶囊、口服液等制剂。 本发明具有如下有益效果： ①基于抗氧化与免疫调节作用的相关性，本发明采用抗氧化活性导向分离林蛙油 免疫调节多糖，所提供的多糖组分兼具了显著的抗氧化与增强机体免疫力作用。 ②本发明所述的林蛙油多糖组分属于糖-蛋白复合物，增强机体免疫力的作用往 往高于单纯多糖(Int.J.Biol.Macromol.65(2014)441-445)。 ③本发明所述的林蛙油多糖组分低剂量下就可以显著地增强巨噬细胞吞噬能力 及增加一氧化氮(NO)生成量；而对巨噬细胞生长既没有增殖也没有抑制作用，显示良好的 安全特性。 附图说明 图1.林蛙油纯化多糖的DEAE-52洗脱曲线； 图2.林蛙油多糖组分POR-3单糖组成的高效液相色谱图(Man,甘露糖；GlcN,氨基 5 CN 111548429 A 说　明　书 3/7 页 葡萄糖；GalA,半乳糖醛酸；Gal,半乳糖；Fuc,岩藻糖)； 图3.林蛙油多糖组分POR-3的分子量分布图； 图4.林蛙油多糖组分POR-3的紫外扫描图； 图5.林蛙油多糖组分POR-3的红外光谱图； 图6.林蛙油多糖组分POR-3的1H-核磁共振谱图； 图7.林蛙油多糖组分POR-3的13C-核磁共振谱图； 图8.林蛙油多糖组分POR-3对巨噬细胞增殖的影响(NC，空白对照；LPS，脂多糖)； 图9.林蛙油多糖组分POR-3对巨噬细胞吞噬能力的影响(NC，空白对照；LPS，脂多 糖)； 图10.林蛙油多糖组分POR-3对NO生成量的影响(NC，空白对照；LPS，脂多糖)。