技术摘要：
本发明公开了一种活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用，本发明通过控制角蛋白酶的反应条件，从羊毛废弃物中提取了具有生物活性的大分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能够有效促进成纤维细胞的增殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能  全部
背景技术：
羊毛加工在我国早已兴起，经过长时间发展，我国已成为羊毛进口与羊毛制品生 产大国，但是国内毛纺企业每年羊毛加工产生的羊毛废弃物高达几十万吨，同时畜牧养殖 和畜牧加工产业中也有大量废弃羊毛产生。如果不加以利用，这些废弃物会加深环境污染 的同时，也是一种巨大的浪费。羊毛纤维中蛋白质含量高达99％，是一种优质的蛋白质资 源。近年来，随着对角蛋白研究的深入，研究者们发现角蛋白是一种具有良好生物相容性和 可生物降解性的天然生物材料。因此，角蛋白在组织工程和医学应用上表现出应用潜力，如 促进伤口愈合和骨再生，种植体材料，止血敷料，和药物缓释等。本专利从羊毛废弃物中提 取活性大分子角蛋白，不仅实现了羊毛纤维的回收再利用，也提供了一种有价值的生物活 性材料。 羊毛纤维具有由二硫键、氢键和范德华力高度相交和连接的复杂立体结构，具有 极强的抗性，难以溶解于水、弱酸弱碱、有机溶剂等，给角蛋白的提取再利用带来了极大的 困难。传统提取活性大分子角蛋白的方法主要依赖于含巯基化合物，如巯基乙醇、巯基乙 酸；或者含硫化合物，如亚硫酸盐、EDTA、DTT等有毒有害化学试剂，会对环境造成二次污染 以及有毒试剂残留。角蛋白酶是公认的能够降解羊毛、羽毛等角蛋白质废弃物的生物酶，然 而降解产品目前主要是氨基酸和低分子小肽，应用于肥料和饲料等领域，附加值较低。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明采用角蛋白酶，在温和的反应条件下从羊毛废弃物 中提取了具有生物活性的大分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能 够有效促进成纤维细胞的增殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能；该再生角蛋白粉末可 自组装成水凝胶，能够诱导组织再生修复，有效促进伤口愈合，可作一种良好的医用生物敷 料。 本发明的第一个目的是提供一种活性大分子角蛋白的制备方法，包括如下步骤： (1)将羊毛纤维洗净，用脱脂溶剂脱脂12～24h，清洗去除表面残留的脱脂溶剂，烘 干剪碎，得到脱脂羊毛纤维； (2)将步骤(1)的脱脂羊毛纤维分散在水中，调节pH至9～11，在65～95℃搅拌反应 1～2h； (3)将步骤(2)的反应液温度降低至45～50℃，加入100～200KU酶活的角蛋白酶液 进行酶解48-60h； (4)将步骤(3)酶解后的反应液进行离心，取上清液，进行透析、冷冻干燥，得到所 述的角蛋白。 3 CN 111606990 A 说　明　书 2/7 页 进一步地，在步骤(1)中，所述的脱脂溶剂为醚、苯、二硫化碳、丙酮、氯仿中的一种 或多种混合。 进一步地，在步骤(1)中，清洗是采用水清洗，清洗温度为40～60℃。 进一步地，在步骤(1)中，脱脂羊毛纤维剪碎的长度为1～5cm。 进一步地，在步骤(2)中，脱脂羊毛纤维与水的固液比为1:10～30。 进一步地，在步骤(4)中，离心的条件为10000-14000rpm离心20～40min。 进一步地，在步骤(4)中，透析时，透析膜的截留分子量为8000～14000Da。 进一步地，在步骤(4)中，冷冻干燥的条件为在-80℃下冷冻6～12h，在冷冻干燥机 上干燥48～72h。 本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的角蛋白。 本发明的第三个目的是提供所述的角蛋白在制备生物敷料中的应用。 本发明的有益效果： 本发明通过控制角蛋白酶的反应条件，从羊毛废弃物中提取了具有生物活性的大 分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能够有效促进成纤维细胞的增 殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能；该再生角蛋白粉末可自组装成水凝胶，能够诱导组 织再生修复，有效促进伤口愈合，可作一种良好的医用生物敷料。本发明操作工艺简单，设 备成本低廉，易于工业化生产；本方法以畜牧业及纺织工业中废弃羊毛、羊绒等纤维及不能 用于纺织加工的羊毛短纤维为原料，既节约资源又保护环境；本方法使用角蛋白酶进行生 物提取，提取过程绿色环保，不产生污染。 附图说明 图1为再生角蛋白分子量表征，A.SDS-PAGE检测结果；B.HPLC检测结果。 图2为再生角蛋白结构表征，A.红外光谱；B.固体核磁碳谱；C.X射线衍射；D.圆二 色谱。 图3为再生角蛋白生物活性表征，A.促细胞增殖作用；B.促细胞迁移作用。 图4为再生角蛋白抗氧化活性表征，A.ABTS自由基清除能力；B.细胞内活性氧ROS 清除能力。 图5为再生角蛋白自组装成水凝胶。 图6为再生角蛋白水凝胶促伤口愈合效果评价。