技术摘要：
本发明公开了一种超高效合相色谱测定游离态和质子化尼古丁含量的方法，属于化学分析检测技术领域，包括对尼古丁标准溶液的制备，待测样品溶液的制备，其中包括制备游离态尼古丁和质子化尼古丁，然后通过超高效合相色谱仪直接进行检测即可，进行定量分析，可适用于对游  全部
背景技术：
尼古丁，俗名烟碱，属于吡啶族生物碱，是烟草的主要致瘾成分，对人有很强的生 理作用。电子烟的出现，即能满足人们对尼古丁的需求，同时不产生焦油和一氧化碳，而且 口味众多，可以满足不同人群的个性需求。随着全球禁烟政策的开展，电子烟的需求量不断 增长，中国电子烟市场近年来呈现快速增长的态势。随着电子烟行业的发展，人们发现吸食 电子烟很难获得传统香烟带来的满足感。这是因为电子烟设备在血液尼古丁的输送上并不 理想，高浓度的尼古丁只有一小部分进入血液，大部分停留在喉咙上，产生过度刺激，使得 用户体验感很差。 尼古丁盐是尼古丁与有机酸结合的产物，在性质上更稳定。同时，根据相关研究表 明尼古丁盐比尼古丁的穿透力强，更容易进入人体血液中，在短时间内就可以满足人们对 尼古丁的需求，口感醇和，不会过度刺激喉咙，可以提供一种接近于真烟的满足感。因此，在 电子烟油中加入尼古丁盐成为一种新的趋势和卖点，而烟油中游离态和质子化尼古丁的比 例对电子烟的口感和劲头影响较大，分析游离态和质子化尼古丁的比例备受人们关注。 超高效合相色谱(Ultra  performance  convergencechromatography,UPC2)技术 源于超临界流体色谱技术，由于其以超临界CO2为主要的流动相，依靠流动相的溶剂化能力 来进行分离、分析，既能分析不适用于气相色谱的高沸点、低挥发、遇热不稳定的样品，又能 提高高效液相色谱的分析速度和柱效；结合2μm填料技术，使其具有更高的分离能力，更高 的分析效率，能够通过精确地调节流动相强度、压力和温度，获得所需的系统分辨率和选择 性，对待测物的保留和分离进行有效调控，相对于高效液相色谱，超高效合相色谱具有扩散 效率更高，传质效果更好，操作温度低，灵敏度高、分离效率高、重复性好、分析速度快以及 绿色环保，可有效降低有毒溶剂对试验人员的身体健康的损害等优点。 在烟草及烟草制品中，游离烟碱与质子态烟碱存在动态的平衡，游离烟碱的含量 容易受到诸如水分、温度、溶剂和ph等因素的干扰，因此，有关烟草制品中游离烟碱的准确 测定仍然为本领域的一项技术难题，基于此，建立一种既可以测试游离烟碱、又可以测试质 子化尼古丁，且环境干扰少、测定准确的方法对于分析检测人员而言存在较大的困难，目 前，关于尼古丁含量分析的报道大多是测定总尼古丁，只有少量文献报道了卷烟中游离态 和质子化尼古丁的液相检测方法，且目前存在的测试方法均对游离烟碱和质子化尼古丁存 在环境有不同程度的破坏，因此，建立一种能够准确测定烟草及烟草制品中游离和质子化 尼古丁含量的超高效合相色谱测试的方法很有必要，目前的公开文献尚未见有此类的相关 报道。 4 CN 111579652 A 说　明　书 2/9 页
技术实现要素：
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种超高效合相色谱测定游离态和 质子化尼古丁含量的方法，能够有效、快速检测游离态和质子化尼古丁的含量。 为实现上述目的，本发明提供一种超高效合相色谱测定游离态和质子化尼古丁含 量的方法，包括： (1)尼古丁标准溶液的制备：称取尼古丁对照品，通过色谱甲醇超声溶解定容，再 进行移液，用二氯甲烷定容，过滤、得到一系列不同浓度标准液； (2)待测样品游离态尼古丁溶液的制备：准确称取样品用超纯水定容，移至具塞离 心管，再用二氯甲烷进行多次萃取、合并每次萃取得到的二氯甲烷层，定容，过滤，得到待测 滤液Ⅰ。 (3)待测样品质子化尼古丁溶液的制备：在步骤(2)中萃取后的具塞离心管的水相 中加入饱和氢氧化钠，再用二氯甲烷进行多次萃取、合并每次萃取得到的二氯甲烷层，定 容，过滤得到待测滤液Ⅱ。 (4)精密吸取步骤(1)得到的标准溶液注入超高效合相色谱仪中进行检测即可；精 密吸取步骤(2)和步骤(3)得到的待测滤液Ⅰ和待测滤液Ⅱ注入超高效合相色谱仪中进行检 测即可。 其中，超高效合相色谱仪的色谱条件：流动相是超临界CO2，辅助溶剂为甲醇、乙 醇、异丙醇、乙腈中的一种。 其中，所述标准工作液配置包括： (1)称取尼古丁对照品100mg于50ml容量瓶中，色谱甲醇超声溶解定容，得到浓度 为2000mg·L-1标准母液； (2)将步骤(1)得到的标准母液用移液管分别准确移取0 .1mL、0 .2mL、0 .5mL、 0.8mL、1mL至10mL容量瓶中，二氯甲烷定容，过滤得到20mg·L-1、40mg·L-1、100mg·L-1、 160mg·L-1、200mg·L-1一系列不同浓度标准液。 其中，在步骤(2)中，待测样品游离态尼古丁溶液的制备包括： (1)准确称取电子烟油样品于10mL容量瓶中，超纯水定容，转移至50mL具塞离心管 中； (2)加入5-20mL二氯甲烷于步骤(1)的具塞离心管中，上下摇晃，静置1-5min，取下 层(二氯甲烷层)于容量瓶中； (3)重复步骤(2)1-3次，将每次得到的下层合并，二氯甲烷定容，过滤得到待测滤 液Ⅰ。 其中，在步骤(2)中，待测样品游离态尼古丁溶液的制备包括： (1)准确称取电子烟油样品于10mL容量瓶中，超纯水定容，转移至50mL具塞离心管 中； (2)加入10mL二氯甲烷于步骤(1)的具塞离心管中，上下摇晃，静置1-5min，取下层 (二氯甲烷层)于容量瓶中； (3)重复步骤(2)，将两次得到的下层合并，二氯甲烷定容，过滤得到待测滤液Ⅰ。 其中，在步骤(3)中，待测样品质子化尼古丁溶液的制备包括：向步骤(2)中萃取后 的具塞离心管的水相中加入10-500μL饱和氢氧化钠溶液，摇匀静置1-10min，用二氯甲烷萃 5 CN 111579652 A 说　明　书 3/9 页 取两次，合并二氯甲烷下层，二氯甲烷定容，过滤得到待测滤液Ⅱ。 其中，在步骤(3)中，待测样品质子化尼古丁溶液的制备包括：向步骤(2)中萃取后 的具塞离心管水相中加入500μL饱和氢氧化钠溶液，摇匀静置1-10min，用二氯甲烷萃取两 次，合并下层，二氯甲烷定容，过滤得到待测滤液Ⅱ。 其中，在步骤(4)中所述超高效合相色谱进行检测的参数条件具体为：流速：0.5- 3mL·min-1；检测波长：220-300nm；进样量：0.5-10μL；色谱柱温：30-80℃；系统背压1500- 2000pis；等度洗脱2-4min；流动相是超临界CO2，辅助溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的 一种。 其中，在步骤(3)中所述超高效合相色谱进行检测的参数条件具体为：流速： 2.5mL·min-1；检测波长：259nm；进样量：2μL；色谱柱温：50℃；系统背压2000pis；等度洗脱 2min：CO2(90％)，辅助溶剂甲醇(10％)。 其中，在步骤(2)中，所述样品包括电子烟油和/或自制尼古丁盐。 其中，在步骤(1)-步骤(3)中，过滤的条件为：经0.22μm微孔滤膜过滤。 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的超高效合相色谱测定游离 和质子化尼古丁含量的方法有益效果为： (1)采用超高效合相色谱，无需旋蒸，有机溶剂直接进样，大大缩短了样品前处理 时间； (2)采用超临界二氧化碳为主要流动相，低比例有机溶剂为辅助溶剂，分离效率 高，节约溶剂，很大程度上降低了废液处理成本，绿色环保。同时流动相不易损耗柱子，节约 成本； (3)样品分析时间短，且峰形好，样品基质无干扰，可以作为市售电子烟油和尼古 丁原料质量控制的一种快速、方便、可靠的检测手段。 附图说明 图1为本发明的溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈的色谱图； 图2为本发明的空白溶剂、标准溶液和待测溶液的色谱图； 图3为本发明二氯甲烷萃取第一次、第二次和第三次的色谱图； 图4为本发明的氢氧化钠10、30和50μL的色谱图； 图5为本发明的标准曲线图。