技术摘要：
本公开提供了包括在封闭系统中使用本文公开的方法，由包含少量TIL的细针抽吸物(FNA)或小活检物扩增TIL群的方法，该方法在更短的时间内使得TIL的表型改善和代谢健康增加。
背景技术：
使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltrating lymphocyte)治 疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。Gattinoni等， Nat.Rev.I mmunol.，2006，6，383-393。成功的免疫治疗需要大量的TIL，商业化需要稳健可 靠的方法。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这是一项需要实现的挑战。由于其速度 和效率，基于IL-2的TIL扩增随后进行“快速扩增过程”(REP，rapid expansion process)已 成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等， J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell 等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。REP可在14天 内使TIL扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的 同种异体外周血单核细胞((PBMC，peripheral blood mononuclear cell)，也称为单核细 胞(MNC))作为饲养细胞(feeder cell)，以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等 J.I mmunother.2003,26,332-42。经历REP程序的TIL在黑色素瘤患者的宿主免疫抑制后产 生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数(infusion acceptance parameter)依 赖于TIL组成的读数(例如CD28、CD8或CD4阳性)以及REP产物的倍数扩增和活力。 目前的TIL生产过程受到如何从患者获得TIL的限制。在某些情况下，如果肿瘤足 够小或处于无法进行肿瘤切除的位置，则仍需要获得用于扩增和治疗的TIL的其他方法。本 发明通过提供由细针抽吸物(FNA，fine needle aspirate)或芯针活检物(core needle biopsy)(其包含少量TIL)扩增TIL并在治疗方法中使用这些扩增的TIL的方法来满足此需 求。
技术实现要素：
本发明提供了改进的和/或缩短的方法，用于扩增由细针抽吸物或核心活检物 (core biopsy)分离的TIL并产生治疗性TIL群。 本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 括： (i)由来自患者肿瘤的至少一个细针抽吸物(FNA)或至少一个小活检物(small biopsy)获得第一TIL群； (ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；可选地，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行 约3天至约10天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12 12 CN 111601883 A 说 明 书 2/214 页 天，第二TIL群包含至少5×107个TIL；以及 (iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增(priming first expansion)步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增(rapid second expansion)步骤。 根据权利要求1或2所述的方法，在步骤(iii)之后，将细胞从细胞培养物中取出并 在步骤(iv)之前冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在进行步骤(iv)之前解冻细胞。 重复步骤(iv)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的治疗有效剂量来说足 够的TIL。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约17天至约24天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约18天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约20天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约22天。 在一些实施方式中，来自步骤(iii)或(iv)的细胞表达CD4、CD8和TCRαβ的水平与 新鲜收获的细胞相似。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，在步骤(ii)的第3天至第12天中的任一天和/或步骤(iii)的 第11天至第14天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，步骤 (iv)的治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征： CD27表达、CD28表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，所述患者先前 13 CN 111601883 A 说 明 书 3/214 页 已经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(iii)一至四次，在治疗性TIL群中获得对于TIL的治 疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群 的方法，该方法包括： (i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检 物的第一TIL群进行第一次扩增，获得第二TIL群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞 培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一 TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天，第二TIL群包含至少5×107个TIL；以及 (ii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中来自细胞培养基的细胞取出 并冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(i)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，通过向第三TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的另外的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，所述患者先前 已经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 14 CN 111601883 A 说 明 书 4/214 页 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(ii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T 细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更 长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括： (i)由获自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL； (iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (iv)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(ii)之后，将细胞从细胞培养物中取出并在步骤(iv) 之前冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iv)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，重复步骤(iii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 15 CN 111601883 A 说 明 书 5/214 页 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(iv)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 本发明还提供了根据权利要求50至66中任一项所述的方法，其中，相对于第二TIL 群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群 中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一 种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、 肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括： (i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检 物的第一TIL群进行第一次扩增，获得第二TIL群；在第1天至第3天中的任一天向细胞培养 基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL 群来自小活检物时，经过约3天至约12天，第二TIL群包含至少5×107个TIL； (ii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (iii)给患者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中来自细胞培养基的细胞取出 并冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 16 CN 111601883 A 说 明 书 6/214 页 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(i)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(ii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T 细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更 长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 本发明还提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 括： (a)由获自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (b)将第一群加到封闭系统中； (c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL；其中，第一次扩增在提供第一透气表面区域的封闭容器 中进行；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比 第一TIL群的数量大至少25倍；其中，步骤(b)向步骤(c)的过渡在不打开系统的情况下发 生； (d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进 行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其 中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面区域的封闭容器中进 行；其中，步骤(c)向步骤(d)的过渡在不打开系统的情况下发生； (e)收获由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，步骤(d)向步骤(e)的过渡在不打开系统 17 CN 111601883 A 说 明 书 7/214 页 的情况下发生；以及 (f)将步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋，其中，步骤(e)向步骤(f)的过渡在不打开系 统的情况下发生。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存步骤(f) 中包含收获的TIL群的输液袋。 在一些实施方式中，使用1：1比率的收获的TIL群与CS10培养基进行冷冻保存方 法。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，PBMC是经辐照且同种异体的。 在一些实施方式中，在步骤(c)的第3天至12天中的任一天和/或步骤(d)的第3天 至12天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(c)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(d)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(a)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(a)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(a)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用LOVO细胞处理系统来进行。 在一些实施方式中，细胞培养基装在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供。 在一些实施方式中，步骤(f)中的输液袋是HypoThermosol输液袋。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约17天至约24天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约18天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约20天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行22天以下。 在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。 在一些实施方式中，步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含对于TIL的治疗有效剂量 18 CN 111601883 A 说 明 书 8/214 页 来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，步骤(b)至(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器 中进行步骤(b)至(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至(e)使得每个切除肿瘤的TIL产量 增加。 在一些实施方式中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈 递细胞添加到TIL中。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治疗 性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27 表达、 CD28 表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获 自第三TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。 在一些实施方式中，将来自步骤(g)的TIL注入患者体内。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括以下步骤： (a)由从受试者切除的肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (b)将第一群加到封闭系统中； (c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL；其中，第一次扩增在提供第一透气表面区域的封闭容器 中进行；其中，第一次扩增进行约3至14天以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一 TIL群的数量大至少25倍；其中，步骤(b)向步骤(c)的过渡在不打开系统的情况下发生； (d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进 行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约3至12天，获得第三TIL群；其中，第 三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面区域的封闭容器中进行；其 中，步骤(c)向步骤(d)的过渡在不打开系统的情况下发生； (e)收获由步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(d)向步骤(e)的过渡在不打开系统 的情况下发生；以及 (f)将步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋，其中，步骤(e)向步骤(f)的过渡在不打开系 统的情况下发生； (g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；以 及 (h)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群，该第三TIL群来自步骤(g)的输液袋。 在一些实施方式中，步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含足够的TIL，用于在步骤 (h)中施用治疗有效剂量的TIL。 19 CN 111601883 A 说 明 书 9/214 页 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(c)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(d)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(a)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，足够用于在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL的数量为约 2.3×1010至约13.7×1010。 在一些实施方式中，抗原呈递细胞(APC)是PBMC。 在一些实施方式中，在步骤(c)的第3天至12天中的任一天和/或步骤(d)的第3天 至12天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已给患者施 用了非清髓性(non-myeloablative)淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)方案。 在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环 磷酰胺2天、然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天的步骤。 在一些实施方式中，该方法还包括如下步骤：在步骤(h)中给患者施用TIL细胞后 的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。 在一些实施方式中，高剂量IL-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注(bolus intravenous infusion)方式施用600,000或720,000IU/kg，直至耐受。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治疗 性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27 表达、 CD28 表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治 疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56表达降低。 本发明还提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 20 CN 111601883 A 说 明 书 10/214 页 括： (a)由来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)、小活检物、核心活检物或小活检物获得第一 TIL群； (b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群来进 行启动第一次扩增，产生第二TIL群；其中，启动第一次扩增在具有第一透气表面区域的容 器中进行约1至14天的第一阶段以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量大于第一TIL群； (c)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和APC进行快速第二次扩 增，产生第三TIL群；其中，快速第二次扩增进行约1至约14天的第二阶段以获得第三TIL群； 其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (d)收获步骤(c)的治疗性TIL群。 在一些实施方式中，第一阶段为约6至12天。 在一些实施方式中，第二阶段为约6至12天。 在一些实施方式中，第一阶段选自5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。 在一些实施方式中，第二阶段选自5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，步骤(b)中所用的APC与步骤(c)中所用的APC的比率为约1.1： 1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1、2：1、2.1：1、2.2：1、2.3：1、2.4： 1、2.5：1、2.6：1、2.7：1、2.8：1、2.9：1、3：1、3.1：1、3.2：1、3.3：1、3.4：1、3.5：1、3.6：1、3.7： 1、3.8：1、3.9：1、4：1、4.1：1、4.2：1、4.3：1、4.4：1、4.5：1、4.6：1、4.7：1、4.8：1、4.9：1或5：1， 优选为约1至2。 在一些实施方式中，第一TIL群获自核心活检物。 在一些实施方式中，核心活检物从选自下组的肿瘤中获得：黑色素瘤肿瘤、卵巢癌 肿瘤、宫颈癌肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤、肺癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、由人乳 头状瘤病毒引起的癌症的肿瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))肿瘤、胶质母细胞瘤 肿瘤、胃肠道癌肿瘤和肾癌肿瘤。 本发明还提供了包含使用本文所述方法扩增的TIL的组合物。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂(cryopreservant)。 在一些实施方式中，冻存剂包括二甲基亚砜。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂，所述冻存剂包括二甲基亚砜， 所述等渗剂包括氯化钠、葡萄糖酸钠和乙酸钠。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂，所述冻存剂包括二甲基亚砜 和右旋糖酐40，所述等渗剂包括氯化钠、葡萄糖酸钠和乙酸钠。 在一些实施方式中，包含TIL的组合物装在无菌输液袋中提供。 附图说明 图1：概述了步骤A至F的示例性过程2A图。 图2：过程2A的过程流程图。 图3：显示了冷冻保存的TIL示例性生产过程(约22天)的实施方式的图。 21 CN 111601883 A 说 明 书 11/214 页 图4：显示了过程2A(22天的TIL生产过程)的实施方式的图。 图5：过程1C和过程2A的示例性实施方式的步骤A至F的比较表。 图6：过程1C的实施方式和过程2A的实施方式的详细比较。 图7：概述了小活检物扩增过程的步骤A至F的示例性小活检图。 图8：由取自胰腺癌患者(P7015)的核心活检物扩增的活细胞的图像。A)用IL-2处 理的核心活检物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物。 图9：从胰腺核心活检物扩增的TIL的FACS分析。A)由用IL-2处理的核心活检物扩 增得到的T细胞为CD4 和CD8 。B)由用IL-2处理的核心活检物扩增得到的CD8 T细胞为 CD107a 。C)由用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物扩增得到的T细胞为CD4 和 CD8 。D)由用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物扩增得到的CD8 T细胞为CD107a 。 图10：由宫颈癌患者(C2005)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)用IL-2 处理的细针抽吸物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的细针抽吸物。 图11：由肺癌患者(L4032)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)用IL-2处 理的细针抽吸物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的细针抽吸物。C)作为对照，肺 肿瘤碎片用IL-2培养并扩增产生CD4 和CD8 T细胞。 图12：使用快速扩增方案进一步扩增来自肺癌患者(L4032)的FNA样品的TIL。A)对 由抽吸物扩增的TIL进行快速扩增之后的总细胞数，该抽吸物先用单独的IL-2处理、用IL- 2、IL-15和IL-21的组合处理或先用IL-2、IL-15和IL-21的组合然后用单独的IL-2处理。B) CD4 和CD8 T细胞存在于用Il-2处理的扩增TIL群中。 图13：由肺癌患者(L4033)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)来自用IL- 2处理的细针抽吸物的T细胞；以及B)作为对照，来自用IL-2培养的肺肿瘤碎片的T细胞。 图14：使用快速扩增方案进一步扩增由肺癌患者(L4033)的细针抽吸物扩增得到 的TIL。A)对由经IL-2处理的细针抽吸物获得的TIL进行快速扩增之后的总细胞数。 图15：取自卵巢癌患者(OV8011、OV8012和OV8013)的卵巢肿瘤的细针抽吸物的 TIL。用IL-2或IL-2、IL-15和IL-21的组合对细针抽吸物进行培养之后的总细胞数。 图16：由黑色素瘤患者(M1101)的细针抽吸物扩增的TIL的FACS分析。A)来自用IL- 2处理的细针抽吸物的T细胞；以及B)作为对照，来自用IL-2培养的肺肿瘤碎片的T细胞。 图17：通过核心活检获得的源自胰腺肿瘤样品的TIL的表型和功能状态。A)在具有 IL-2的培养基或具有IL-2和细胞培养添加剂的培养基中培养的胰腺肿瘤的结果。B和C)在 用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激之后，在不同培养基(补充IL-2的培养基与补 充添加剂的培养基)中的CD4 细胞和CD8 细胞的CD107a表达的结果。 图18：核心活检物和细针抽吸物的结果汇总表。A)胰腺癌和肺癌样品的结果。B)结 肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌和黑色素瘤样品的结果。 图19：通过细针抽吸活检物获得的源自黑色素瘤样品的TIL的表型和功能状态。A) 0天、11天，18天和21天后细胞培养物的总细胞数。B)源自碎片和抽吸物的细胞的表型分析。 B)用PMA刺激后，源自碎片和抽吸物的细胞的功能分析(CD107a表达)。 图20：显示可由UPMC(匹兹堡大学医学中心)获得的胰腺癌核心活检物扩增TIL的 数据概述。 22 CN 111601883 A 说 明 书 12/214 页 图21：显示了源自胰腺肿瘤的TIL的一般表型的数据。 图22：通过IFN-γ和CD107a测定，由胰核心物的pre-REP和REP分离的TIL是功能性 的。 图23：在低扩增的Pre-REP肺TIL中观察到CD3 /NK细胞群增加。 图24：大多数Pre-REP肺TIL中的CD4/CD8比率高于1。 图25：REP期间，高产量和低产量均观察到相当的倍数扩增。 图26：关于肉瘤(UPMC 58)的数据。 图27：关于宫颈癌(UPMC45)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩增Pre-REP TIL 21 天。 图28：关于ES19001(UPMC46)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩增Pre-REP TIL 21天。 图29：关于硬腭(UPMC 67)和口腔癌(UPMC 68)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩 增Pre-REP TIL 21天。 图30：显示TIL可由UPMC提供的胰腺癌核心活检物扩增的数据概述。 [0200] 图31：胰腺核心活检物：可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7015实验概述和结 果：将一个核心物放入24孔板的一个孔中，总共5个孔。将两个核心物放入两个孔中，但这些 孔中几乎没有生长。用1)IL-2处理三个孔，用2)IL-2/IL-15/IL-21处理两个孔。 [0201] 图32：数据显示由胰腺核心物扩增的大多数细胞是CD4 T细胞和CD8 T细胞，且如 通过CD107a表达(P7015)所测定地是功能性的。P7015实验结果：由胰腺核心活检物扩增的 大多数细胞为T细胞(约80％为CD4 和CD8 )。PMA/I刺激显示CD8 脱粒的能力，如通过 CD107a 表达所示，从而表明这些细胞是功能性的。与单独的IL-2相比，在IL-2/IL-15/IL- 21三重混合物条件下，表达CD107a 的CD8 的百分比更高。 [0202] 图33：胰腺核心活检物：可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7028和P7031pre-REP 实验概述和结果：将11个核心活检物与三重混合物(IL-2/IL-15/IL-21)放在G-Rex10中。在 第12天评估P7028TIL，继续培养直至第19天。细胞计数：第21天＝1.61e6个活细胞；第21天 ＝3.49e7个活细胞。在第12天评估P7028TIL，继续培养直至第27天。细胞计数：第12天＝ 1.52e5个活细胞；第27天：1.14e7个活细胞。 [0203] 图34：胰腺核心活检物：可由经IL-2/IL-15/IL-21处理的来自胰腺癌的核心活检 物和碎片扩增TIL。源自碎片的TIL的收获日为第11天至21天。源自核心物的TIL的收获日为 第21至28天。 [0204] 图35：源自核心物和肿瘤活检物的TIL的表型表征。源自碎片的TIL的收获日为第 11天至21天。源自核心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0205] 图36：源自核心物和肿瘤活检物的TIL的表型表征。 [0206] 图37：与分离自碎片的TIL相似，来自核心活检物的TIL可表达CD107a并分泌IFN γ。 [0207] 图38：A)核心活检扩增程序的示例性过程。对1至2个核心活检物(3个胰腺、4个黑 色素瘤、1个乳腺和1个卵巢)进行示例性处理，包括在第3天添加OKT3 饲养细胞。胰腺核心 物扩增 /-IL-15和IL-21(REP1和REP2；即，第一次扩增和第二次扩增)。处理卵巢核心物 /- OX40(BMS)(n＝1)。所有TIL均进行第二次REP(第二次扩增)。B)核心活检扩增程序的示例性 23 CN 111601883 A 说 明 书 13/214 页 过程。1至2个核心活检物需经历其中包括在第3天添加OKT3 饲养细胞的过程。 [0208] 图39：胰腺核心活检扩增程序的汇总表。 [0209] 图40：关于胰腺核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0210] 图41：黑色素瘤核心活检扩增程序的汇总表。 [0211] 图42：关于黑色素瘤核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0212] 图43：REP1和REP2(即，第一次扩增和第二次扩增)的耗竭标志物和活化标志物的 表型表达相似。 [0213] 图44：与来自碎片的Gen2(即，过程2A)来源的TIL相比，在第3天向核心物添加OKT3 饲养细胞未显著改变TIL的表型。 [0214] 图45：乳腺核心(breast core)和卵巢核心(ovarian core)活检扩增程序的汇总 表。 [0215] 图46：关于乳腺(左)和卵巢(右图)核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0216] 图47：实验表明可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7028和P7031pre-REP的实验 概述和结果。将核心活检物与三重混合物(IL-2/IL-15/IL-21)一起放入G-Rex 10。在第12 天评估P7028TIL，继续培养直至第19天。细胞计数：第12天＝1.61×106个活细胞；第21天＝ 3.49×107个活细胞。在第12天评估P7030TIL，继续培养直至第27天。细胞计数：第12天＝ 1.52×105个活细胞；第27天＝1.14×107个活细胞。 [0217] 图48：可由经IL-2/IL-15/IL-21处理的来自胰腺癌的核心活检物和碎片扩增TIL。 该图显示了碎片和核心物的细胞扩增数。来自碎片的TIL的收获日为第11天至21天。来自核 心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0218] 图49：源自核心物和碎片的TIL在表型上相似。来自碎片的TIL的收获日为第11天 至21天。来自核心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0219] 图50：当比较来自核心物和碎片的TIL时，“耗竭标志物”差异表达。 [0220] 图51：与从碎片分离的TIL相似，来自核心活检物的TIL可表达CD107a并分泌IFN γ。 [0221] 图52：无论初始培养条件(REP1；第一次扩增)如何，TC(三重混合物；IL-2/IL-15/ IL-21)未显著改变REP2(第二次扩增)中胰腺核心物的总细胞数。 [0222] 图53：TC(三重混合物；IL-2/IL-15/IL-21)未显著改变胰腺核心物的REP2(第二次 扩增)中CD4/CD8比率或记忆亚群。 [0223] 图54：在胰腺核心物的所有处理条件下，来自REP2(第二次扩增)的CD4群和CD8群 的CD107a相似。 [0224] 图55：无论胰腺核心物的REP2(第二次扩增)处理条件如何，IFNγ分泌均相似。 [0225] 图56：与胰腺核心物的pre-REP条件相比，在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和 饲养细胞未显著改变表型表达。 [0226] 图57：在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和饲养细胞未显著改变胰腺核心物中 “耗竭标志物”的表型表达。 [0227] 图58：在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和饲养细胞未显著改变胰腺核心物中 活化标志物的表型表达。 [0228] 图59：胰腺核心物的pre-REP、REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中CD4群和 24 CN 111601883 A 说 明 书 14/214 页 CD8群的CD107a相似。 [0229] 图60：与胰腺核心物的REP1(第一次扩增)相比，REP2(第二次扩增)中IFNγ的分泌 减少。 [0230] 图61：在REP2(第二次扩增)中，TCM(中枢记忆T细胞)群增加，而TEM(效应记忆T细 胞)减少；但在黑色素瘤中，CD27和CD28未改变。TEMRA：重新表达CD45RA的末端分化效应记 忆细胞。TSCM：T记忆干细胞(Stem memory T cell)。 [0231] 图62：黑色素瘤核心物REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中的IFNγ和 CD107a相似。 [0232] 图63：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8表型标志物的数据。 [0233] 图64：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8表型标志物的数据。 [0234] 图65：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8的CD107a水平的数据。 [0235] 图66：OX40处理增加了卵巢核心物中CD8 细胞的百分比。 [0236] 图67：OX40处理的卵巢核心物的CD107a表达和IFNγ分泌相似。 [0237] 图68：乳腺核心物的REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中增加的TCM以及耗 竭标志物和活化标志物的差异表达。 [0238] 图69：乳腺核心物的REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中CD107a和IFNγ相 似。 [0239] 图70：示例性肿瘤核心活检TIL扩增程序的示意图。 [0240] 图71：经OKT3 饲养细胞处理的源自胰腺核心物的TIL经再刺激后分泌IFNγ。 [0241] 图72：源自黑色素瘤核心物的TIL经再刺激后表达CD107a并分泌IFNγ。 [0242] 图73：由乳腺核心活检物和卵巢核心活检物扩增TIL。 [0243] 图74：REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的源自乳腺核心物的TIL的终产物表型与 REP1期间仅用IL-2处理的核心物类似。 [0244] 图75：REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的源自乳腺核心物的TIL的终产物表型与 REP1期间仅用IL-2处理的核心物类似。 [0245] 图76：与REP1期间仅用IL-2处理的核心相比，REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的乳 腺核心物的IFNγ分泌表达增加。 [0246] 图77：REP2期间OX40处理增加了卵巢核心物的CD8 细胞的百分比。 [0247] 图78：两个REP期间的OX40处理改变了REP2中PD-1、KLRG1和CD25的表达。 [0248] 图79：终产物(REP2)中经OX40处理的卵巢核心物的IFNγ分泌略高。 [0249] 图80：经OX40处理的卵巢核心物的CD107a表达。 [0250] 图81：两个REP期间的OX40处理改变了与T细胞“年轻(youth)”有关的标志物的表 达。 [0251] 图82：两个REP期间的OX40处理略微改变了REP2中PD-1、KLRG1和CD25的表达。 [0252] 图83：乳腺核心物的REP1和REP2中耗竭标志物和活化标志物的差异表达。 [0253] 图84：乳腺核心物的REP1和REP2中CD107a和IFNγ相似。 [0254] 图85A-85B：A)显示了2A过程(约22天的过程)和用于生产TIL的小活检Gen 3过程 的一个实施方式(约17天至24天的过程)的比较。B)概述了步骤A至F(约17天至24天的过程) 的Gen 3示例流程图。 25 CN 111601883 A 说 明 书 15/214 页 [0255] 图86：提供了GEN 2(过程2A)vs GEN 3的可比性的实验流程图。 [0256] 图84A-87C：A)L4054-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的表型表征。B)L4055-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的表型表征。C)M1085T-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的 表型表征。 [0257] 图88A-88C：A)L4054-GEN 2过程和GEN 3过程的TIL产物的记忆标志物分析。B) L4055-GEN 2过程和GEN 3过程的TIL产物的记忆标志物分析。C)M1085T-GEN2过程和GEN 3 过程的TIL产物的记忆标志物分析。 [0258] 图89：L4054活化标志物和耗竭标志物(A)对CD4 门控和(B)对CD8 门控。 [0259] 图90：L4055活化标志物和耗竭标志物(A)对CD4 门控和(B)对CD8 门控。 [0260] 图91：IFNγ产量(pg/mL)：Gen 2过程和Gen 3过程的(A)L4054、(B)L4055和(C) M1085T：此处表示的每个条形是刺激、无刺激和培养基对照的IFNγ水平的平均值 SEM。在 450nm处测得光密度。 [0261] 图92：细胞培养上清液中IL-2浓度的ELISA分析：(A)L4054和(B)L4055。此处表示 的每个条形是用过的培养基的IL-2水平的平均值 SEM。在450nm处测得光密度。 [0262] 图93：用过的培养基中葡萄糖和乳酸酯的定量(g/L)：(A)葡萄糖和(B)乳酸酯：在 两个肿瘤系和两个过程中，整个REP期间观察到葡萄糖减少。相反，如所预期的，观察到乳酸 酯增加。GEN 2和GEN 3之间，葡萄糖减少和乳酸酯增加均相当。 [0263] 图94：A)L4054和L4055的用过的培养基中L-谷氨酰胺的定量。B)L4054和L4055的 用过的培养基中Glutamax的定量。C)L4054和L4055的用过的培养基中氨的定量。 [0264] 图95：端粒长度分析：使用DAKO试剂盒，相对端粒长度(RTL)值指示了对照细胞系 (1301白血病细胞系)中每个染色体/基因组的端粒荧光的GEN 2和GEN 3过程中每个染色 体/基因组的平均端粒荧光。 [0265] 图96：在Gen 2过程和Gen 3过程下，L4054和L4055的TIL终产物的独特CDR3序列分 析。条柱显示了在GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14至16天)收获日收集的1×106 个细胞中鉴定出的独特TCR B克隆型的数量。基于样品中独特肽CDR的数量，与Gen 2相比， Gen 3显示出更高的克隆多样性。 [0266] 图97：L4054IL收获的最终细胞产物(GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14 至16天))的独特CDR3序列的频率。 [0267] 图98：L4055TIL收获的最终细胞产物(GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14 至16天))的独特CDR3序列的频率。 [0268] 图99：在Gen 2过程和Gen 3过程下，L4054和L4055的TIL终产物的多样性指数。香 农熵多样性指数(Shanon entropy diversity index)是用于比较的更可靠和更通用的指 标。Gen 3L4054和L4055显示出比Gen 2略高的多样性。 [0269] 图100：表37中所示的第7天-开始Gen 3REP的细胞计数的原始数据(参见下文实施 例14)。 [0270] 图101：表37中所示的第11天-开始Gen 2REP和Gen 3按比例扩增(Scale Up)的细 胞计数的原始数据(参见下文实施例14)。 [0271] 图102：表38中所示的第16天-Gen 2按比例扩增和Gen 3收获(例如第16天)的细胞 计数的原始数据(参见下文实施例14)。 26 CN 111601883 A 说 明 书 16/214 页 [0272] 图103：表38中所示的第22天-Gen 2收获(例如第22天)的细胞计数的原始数据(参 见下文实施例14)。对于L4054Gen 2，将LOVO后的计数外推至4个烧瓶，因为这是研究总数。 污染了1个烧瓶，进行外推得出总计＝6.67×1010。 [0273] 图104：图87A、87A和87B所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0274] 图105：图87C和87C所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0275] 图106：图89和90所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0276] 图107：图91所示的L4054样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0277] 图108：图91所示的L4055样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0278] 图109：图91所示的M1085T样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0279] 图110：图92所示的IL-2ELISA测定结果的原始数据。 [0280] 图111：图93和94所示的代谢底物和代谢分析结果的原始数据。 [0281] 图112：图95所示的相对端粒长度分析结果的原始数据。 [0282] 图113：图96和99所示的独特CD3序列和克隆多样性分析结果的原始数据。 [0283] 图114：显示了各种Gen 2(2A过程)与Gen 3.1过程实施方式的比较。 [0284] 图115：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3过程的实施方式的各种特征的表。 [0285] 图116：Gen 3过程(称为Gen 3.1)的实施方式的培养基条件的概述。 [0286] 图117：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3过程的实施方式的各种特征的表。 [0287] 图118：比较了Gen 2和Gen 3.0过程的实施方式的各种特征的表。 [0288] 图119：提供了所述扩增过程的各个实施方式的培养基使用的表。 [0289] 图120：表型比较：该过程的Gen 3.0和Gen 3.1实施方式显示了相当的CD28、CD27 和CD57表达。 [0290] 图121：Gen 3终产物的IFNγ产量更高。用培养的冷冻上清液评估IFNγ分析(通过 ELISA)以比较两个过程。对于用包被的抗-CD3平板过夜刺激的每个肿瘤，使用新鲜的TIL产 物进行每个Gen 2(例如第22天)和Gen 3过程(例如第16天)。每个条形代表刺激、未刺激和 培养基对照的IFNγ水平。 [0291] 图122：上图：TIL终产物的独特CDR3序列分析：条柱显示了由Gen 2(例如第22天) 和Gen 3过程(例如第14至16天)收集的1×106个细胞鉴定出的独特的TCR B克隆型的数量。 基于样品中独特肽CDR的数量，与Gen 2相比，Gen 3显示出更高的克隆多样性。下图：TIL终 产物的多样性指数：香农熵多样性指数是用于比较的更加可靠通用的度量。Gen 3显示出略 高于Gen 2的多样性。 [0292] 图123：Gen 3和Gen 2终产物共享199个序列，对应于Gen 2的独特CDR3序列的前 80％与Gen 3终产物共享97.07％。 [0293] 图124：Gen 3和Gen 2终产物共享1833个序列，对应于Gen 2的独特CDR3序列的前 80％与Gen 3终产物共享99.45％。 [0294] 图125：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方式的示意图。 [0295] 图126：使用Gen 3扩增平台由造血系统恶性肿瘤扩增TIL的方法的示例性实施方 式的示意图。 [0296] 图127：提供的数据显示，与Gen2相比，在第3天向核心物添加OKT3 饲养细胞并未 显著改变TIL的表型，表明TIL是健康TIL。 27 CN 111601883 A 说 明 书 17/214 页 [0297] 图128：提供的数据显示，黑色素瘤核心物来源的TIL的耗竭标志物和活化标志物 的表达遵循与胰腺核心来源的TIL相似的趋势。在REP1和REP2中，IL-2和三重混合物的表型 表达并无差异。 [0298] 图129：提供了关于由肺核心活检物扩增TIL的数据。 [0299] 图130：提供的数据显示，在第0天vs第3天(OKT3 饲养细胞)处理的肺核心物中观 察到相似的表型概况。 [0300] 图131：提供的数据显示，在第3天用OKT3和饲养细胞处理的核心物中活化标志物 和驻留T细胞标志物的表型表达增强。 [0301] 图132：如通过响应于非特异性刺激的IFNγ分泌和CD107a动员(mobilization)所 确定的，来自肺核心物的TIL是功能性的。 [0302] 图133：与第0天处理的TIL相比，第3天处理的肺核心物的CD8 TIL是寡克隆的。 序列表说明 [0303] SEQ ID NO：1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。 [0304] SEQ ID NO：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。 [0305] SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。 [0306] SEQ ID NO：4是阿地白介素的氨基酸序列。 [0307] SEQ ID NO：5是重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。 [0308] SEQ ID NO：6是重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。 [0309] SEQ ID NO：7是重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。 [0310] SEQ ID NO：8是重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。 [0311] SEQ ID NO：9是人4-1BB的氨基酸序列。 [0312] SEQ ID NO：10是鼠4-1BB的氨基酸序列。 [0313] SEQ ID NO：11是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(utomilumab) (PF- 05082566)的重链。 [0314] SEQ ID NO：12是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链。 [0315] SEQ ID NO：13是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链可变 区(VH)。 [0316] SEQ ID NO：14是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链可变 区(VL)。 [0317] SEQ ID NO：15是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR1。 [0318] SEQ ID NO：16是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR2。 [0319] SEQ ID NO：17是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR3。 [0320] SEQ ID NO：18是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。 [0321] SEQ ID NO：19是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。 [0322] SEQ ID NO：20是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。 [0323] SEQ ID NO：21是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的 重链。 [0324] SEQ ID NO：22是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。 [0325] SEQ ID NO：23是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区 28 CN 111601883 A 说 明 书 18/214 页 (VH)。 [0326] SEQ ID NO：24是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区 (VL)。 [0327] SEQ ID NO：25是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。 [0328] SEQ ID NO：26是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。 [0329] SEQ ID NO：27是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。 [0330] SEQ ID NO：28是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。 [0331] SEQ ID NO：29是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。 [0332] SEQ ID NO：30是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。 [0333] SEQ ID NO：31是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。 [0334] SEQ ID NO：32是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0335] SEQ ID NO：33是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0336] SEQ ID NO：34是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0337] SEQ ID NO：35是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0338] SEQ ID NO：36是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0339] SEQ ID NO：37是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0340] SEQ ID NO：38是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0341] SEQ ID NO：39是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0342] SEQ ID NO：40是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0343] SEQ ID NO：41是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0344] SEQ ID NO：42是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。 [0345] SEQ ID NO：43是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0346] SEQ ID NO：44是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0347] SEQ ID NO：45是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0348] SEQ ID NO：46是4-1BB配体(4-1BBL)的氨基酸序列。 [0349] SEQ ID NO：47是4-1BBL多肽的可溶部分。 [0350] SEQ ID NO：48是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。 [0351] SEQ ID NO：49是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。 [0352] SEQ ID NO：50是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。 [0353] SEQ ID NO：51是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。 [0354] SEQ ID NO：52是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。 [0355] SEQ ID NO：53是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。 [0356] SEQ ID NO：54是人OX40的氨基酸序列。 [0357] SEQ ID NO：55是鼠OX40的氨基酸序列。 [0358] SEQ ID NO：56是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(tavolixizumab)(MEDI- 0562)的重链。 [0359] SEQ ID NO：57是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链。 [0360] SEQ ID NO：58是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链可变区 (VH)。 29 CN 111601883 A 说 明 书 19/214 页 [0361] SEQ ID NO：59是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链可变区 (VL)。 [0362] SEQ ID NO：60是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。 [0363] SEQ ID NO：61是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。 [0364] SEQ ID NO：62是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。 [0365] SEQ ID NO：63是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。 [0366] SEQ ID NO：64是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。 [0367] SEQ ID NO：65是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。 [0368] SEQ ID NO：66是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。 [0369] SEQ ID NO：67是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。 [0370] SEQ ID NO：68是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。 [0371] SEQ ID NO：69是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。 [0372] SEQ ID NO：70是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。 [0373] SEQ ID NO：71是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。 [0374] SEQ ID NO：72是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。 [0375] SEQ ID NO：73是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。 [0376] SEQ ID NO：74是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。 [0377] SEQ ID NO：75是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。 [0378] SEQ ID NO：76是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。 [0379] SEQ ID NO：77是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。 [0380] SEQ ID NO：78是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。 [0381] SEQ ID NO：79是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。 [0382] SEQ ID NO：80是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。 [0383] SEQ ID NO：81是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。 [0384] SEQ ID NO：82是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。 [0385] SEQ ID NO：83是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。 [0386] SEQ ID NO：84是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。 [0387] SEQ ID NO：85是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。 [0388] SEQ ID NO：86是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。 [0389] SEQ ID NO：87是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。 [0390] SEQ ID NO：88是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。 [0391] SEQ ID NO：89是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。 [0392] SEQ ID NO：90是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。 [0393] SEQ ID NO：91是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。 [0394] SEQ ID NO：92是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。 [0395] SEQ ID NO：93是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。 [0396] SEQ ID NO：94是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。 [0397] SEQ ID NO：95是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。 [0398] SEQ ID NO：96是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。 30 CN 111601883 A 说 明 书 20/214 页 [0399] SEQ ID NO：97是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。 [0400] SEQ ID NO：98是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。 [0401] SEQ ID NO：99是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。 [0402] SEQ ID NO：100是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。 [0403] SEQ ID NO：101是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。 [0404] SEQ ID NO：102是OX40配体(OX40L)的氨基酸序列。 [0405] SEQ ID NO：103是OX40L多肽的可溶部分。 [0406] SEQ ID NO：104是OX40L多肽的替代性可溶部分。 [0407] SEQ ID NO：105是OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。 [0408] SEQ ID NO：106是OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。 [0409] SEQ ID NO：107是OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。 [0410] SEQ ID NO：108是OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。 [0411] SEQ ID NO：109是OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。 [0412] SEQ ID NO：110是OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。 [0413] SEQ ID NO：111是OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。 [0414] SEQ ID NO：112是OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。 [0415] SEQ ID NO：113是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0416] SEQ ID NO：114是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0417] SEQ ID NO：115是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0418] SEQ ID NO：116是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0419] SEQ ID NO：117是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0420] SEQ ID NO：118是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0421] SEQ ID NO：119是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0422] SEQ ID NO：120是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0423] SEQ ID NO：121是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0424] SEQ ID NO：122是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0425] SEQ ID NO：123是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0426] SEQ ID NO：124是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0427] SEQ ID NO：125是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0428] SEQ ID NO：126是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
本公开提供了包括在封闭系统中使用本文公开的方法，由包含少量TIL的细针抽吸物(FNA)或小活检物扩增TIL群的方法，该方法在更短的时间内使得TIL的表型改善和代谢健康增加。
背景技术：
使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltrating lymphocyte)治 疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。Gattinoni等， Nat.Rev.I mmunol.，2006，6，383-393。成功的免疫治疗需要大量的TIL，商业化需要稳健可 靠的方法。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这是一项需要实现的挑战。由于其速度 和效率，基于IL-2的TIL扩增随后进行“快速扩增过程”(REP，rapid expansion process)已 成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等， J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell 等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。REP可在14天 内使TIL扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的 同种异体外周血单核细胞((PBMC，peripheral blood mononuclear cell)，也称为单核细 胞(MNC))作为饲养细胞(feeder cell)，以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等 J.I mmunother.2003,26,332-42。经历REP程序的TIL在黑色素瘤患者的宿主免疫抑制后产 生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数(infusion acceptance parameter)依 赖于TIL组成的读数(例如CD28、CD8或CD4阳性)以及REP产物的倍数扩增和活力。 目前的TIL生产过程受到如何从患者获得TIL的限制。在某些情况下，如果肿瘤足 够小或处于无法进行肿瘤切除的位置，则仍需要获得用于扩增和治疗的TIL的其他方法。本 发明通过提供由细针抽吸物(FNA，fine needle aspirate)或芯针活检物(core needle biopsy)(其包含少量TIL)扩增TIL并在治疗方法中使用这些扩增的TIL的方法来满足此需 求。
技术实现要素：
本发明提供了改进的和/或缩短的方法，用于扩增由细针抽吸物或核心活检物 (core biopsy)分离的TIL并产生治疗性TIL群。 本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 括： (i)由来自患者肿瘤的至少一个细针抽吸物(FNA)或至少一个小活检物(small biopsy)获得第一TIL群； (ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；可选地，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行 约3天至约10天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12 12 CN 111601883 A 说 明 书 2/214 页 天，第二TIL群包含至少5×107个TIL；以及 (iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增(priming first expansion)步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增(rapid second expansion)步骤。 根据权利要求1或2所述的方法，在步骤(iii)之后，将细胞从细胞培养物中取出并 在步骤(iv)之前冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在进行步骤(iv)之前解冻细胞。 重复步骤(iv)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的治疗有效剂量来说足 够的TIL。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约17天至约24天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约18天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约20天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约22天。 在一些实施方式中，来自步骤(iii)或(iv)的细胞表达CD4、CD8和TCRαβ的水平与 新鲜收获的细胞相似。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，在步骤(ii)的第3天至第12天中的任一天和/或步骤(iii)的 第11天至第14天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，步骤 (iv)的治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征： CD27表达、CD28表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，所述患者先前 13 CN 111601883 A 说 明 书 3/214 页 已经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(iii)一至四次，在治疗性TIL群中获得对于TIL的治 疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群 的方法，该方法包括： (i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检 物的第一TIL群进行第一次扩增，获得第二TIL群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞 培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一 TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天，第二TIL群包含至少5×107个TIL；以及 (ii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中来自细胞培养基的细胞取出 并冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(i)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，通过向第三TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的另外的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，所述患者先前 已经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 14 CN 111601883 A 说 明 书 4/214 页 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(ii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T 细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更 长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括： (i)由获自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL； (iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (iv)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(ii)之后，将细胞从细胞培养物中取出并在步骤(iv) 之前冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iv)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，重复步骤(iii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(ii)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 15 CN 111601883 A 说 明 书 5/214 页 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(iv)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 本发明还提供了根据权利要求50至66中任一项所述的方法，其中，相对于第二TIL 群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群 中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一 种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、 肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括： (i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检 物的第一TIL群进行第一次扩增，获得第二TIL群；在第1天至第3天中的任一天向细胞培养 基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL 群来自小活检物时，经过约3天至约12天，第二TIL群包含至少5×107个TIL； (ii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群大至少25倍；其中， 第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (iii)给患者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中来自细胞培养基的细胞取出 并冷冻保存在储存培养基中。 在一些实施方式中，在步骤(iii)之前解冻细胞。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 16 CN 111601883 A 说 明 书 6/214 页 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(i)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(iii)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(i)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，重复步骤(ii)一至四次，以在治疗性TIL群中获得对于TIL的 治疗有效剂量来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于第三细胞群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，效应T 细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27表达、CD28表达、端粒更 长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56 表达降低。 本发明还提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 括： (a)由获自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (b)将第一群加到封闭系统中； (c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL；其中，第一次扩增在提供第一透气表面区域的封闭容器 中进行；其中，第一次扩增进行约3天至约12天以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比 第一TIL群的数量大至少25倍；其中，步骤(b)向步骤(c)的过渡在不打开系统的情况下发 生； (d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进 行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约3天至约12天以获得第三TIL群；其 中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面区域的封闭容器中进 行；其中，步骤(c)向步骤(d)的过渡在不打开系统的情况下发生； (e)收获由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，步骤(d)向步骤(e)的过渡在不打开系统 17 CN 111601883 A 说 明 书 7/214 页 的情况下发生；以及 (f)将步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋，其中，步骤(e)向步骤(f)的过渡在不打开系 统的情况下发生。 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存步骤(f) 中包含收获的TIL群的输液袋。 在一些实施方式中，使用1：1比率的收获的TIL群与CS10培养基进行冷冻保存方 法。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，PBMC是经辐照且同种异体的。 在一些实施方式中，在步骤(c)的第3天至12天中的任一天和/或步骤(d)的第3天 至12天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(c)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充IL-15、OX40激 动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(d)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(a)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(a)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(a)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用LOVO细胞处理系统来进行。 在一些实施方式中，细胞培养基装在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供。 在一些实施方式中，步骤(f)中的输液袋是HypoThermosol输液袋。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约17天至约24天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约18天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行约20天至约22天的时间。 在一些实施方式中，步骤(a)至(f)进行22天以下。 在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。 在一些实施方式中，步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含对于TIL的治疗有效剂量 18 CN 111601883 A 说 明 书 8/214 页 来说足够的TIL。 在一些实施方式中，对于治疗有效剂量来说足够的TIL的数量为约2.3×1010至约 13.7×1010。 在一些实施方式中，步骤(b)至(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器 中进行步骤(b)至(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至(e)使得每个切除肿瘤的TIL产量 增加。 在一些实施方式中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈 递细胞添加到TIL中。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治疗 性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27 表达、 CD28 表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获 自第三TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。 在一些实施方式中，将来自步骤(g)的TIL注入患者体内。 本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)，该方法包括以下步骤： (a)由从受试者切除的肿瘤的细针抽吸物(FNA)或小活检物获得第一TIL群； (b)将第一群加到封闭系统中； (c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL 群；其中，在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，第一次扩增进行约 3天至约12天以获得第二TIL群；其中，当第一TIL群来自小活检物时，经过约3天至约12天， 第二TIL群包含至少5×107个TIL；其中，第一次扩增在提供第一透气表面区域的封闭容器 中进行；其中，第一次扩增进行约3至14天以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一 TIL群的数量大至少25倍；其中，步骤(b)向步骤(c)的过渡在不打开系统的情况下发生； (d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进 行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约3至12天，获得第三TIL群；其中，第 三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面区域的封闭容器中进行；其 中，步骤(c)向步骤(d)的过渡在不打开系统的情况下发生； (e)收获由步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(d)向步骤(e)的过渡在不打开系统 的情况下发生；以及 (f)将步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋，其中，步骤(e)向步骤(f)的过渡在不打开系 统的情况下发生； (g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；以 及 (h)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群，该第三TIL群来自步骤(g)的输液袋。 在一些实施方式中，步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含足够的TIL，用于在步骤 (h)中施用治疗有效剂量的TIL。 19 CN 111601883 A 说 明 书 9/214 页 在一些实施方式中，步骤(ii)中包含IL-2的细胞培养基还包含OKT-3，并且不进行 可选的在第1天至第3天中的任一天向细胞培养基中补充OKT-3；其中，步骤(i)是启动第一 次扩增步骤，步骤(ii)是快速第二次扩增步骤。 在一些实施方式中，APC是人工APC(aAPC)或自体APC。 在一些实施方式中，将治疗性TIL群注入患者体内。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(c)中的第一次扩增。 在一些实施方式中，通过向第二TIL群的细胞培养基中进一步补充OKT-3、IL-15、 OX40激动性抗体和/或4-1BB激动性抗体来进行步骤(d)中的第二次扩增。 在一些实施方式中，步骤(a)中的FNA包含至少400,000个TIL。 在一些实施方式中，小活检物从选自胰腺、黑色素瘤、乳腺和卵巢的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，FNA从选自肺、黑色素瘤、头颈、宫颈、卵巢、胰腺、胶质母细胞 瘤、结直肠和肉瘤的肿瘤中获得。 在一些实施方式中，所述肺肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)，可选地，受试者先前已 经历外科治疗。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自FNA。 在一些实施方式中，FNA使用25-18号针头获得。 在一些实施方式中，步骤(i)中的TIL获自小活检物。 在一些实施方式中，小活检物使用16-11号针头获得。 在一些实施方式中，足够用于在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL的数量为约 2.3×1010至约13.7×1010。 在一些实施方式中，抗原呈递细胞(APC)是PBMC。 在一些实施方式中，在步骤(c)的第3天至12天中的任一天和/或步骤(d)的第3天 至12天中的任一天，将PBMC添加至细胞培养物中。 在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已给患者施 用了非清髓性(non-myeloablative)淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)方案。 在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环 磷酰胺2天、然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天的步骤。 在一些实施方式中，该方法还包括如下步骤：在步骤(h)中给患者施用TIL细胞后 的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。 在一些实施方式中，高剂量IL-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注(bolus intravenous infusion)方式施用600,000或720,000IU/kg，直至耐受。 在一些实施方式中，相对于第二TIL群，第三TIL群包含增加的效应T细胞和/或中 枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治疗 性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27 表达、 CD28 表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。 在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治 疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出CD57表达增加和CD56表达降低。 本发明还提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，该方法包 20 CN 111601883 A 说 明 书 10/214 页 括： (a)由来自患者肿瘤的细针抽吸物(FNA)、小活检物、核心活检物或小活检物获得第一 TIL群； (b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群来进 行启动第一次扩增，产生第二TIL群；其中，启动第一次扩增在具有第一透气表面区域的容 器中进行约1至14天的第一阶段以获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量大于第一TIL群； (c)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和APC进行快速第二次扩 增，产生第三TIL群；其中，快速第二次扩增进行约1至约14天的第二阶段以获得第三TIL群； 其中，第三TIL群是治疗性TIL群；以及 (d)收获步骤(c)的治疗性TIL群。 在一些实施方式中，第一阶段为约6至12天。 在一些实施方式中，第二阶段为约6至12天。 在一些实施方式中，第一阶段选自5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。 在一些实施方式中，第二阶段选自5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。 在一些实施方式中，APC是外周血单核细胞(PBMC)。 在一些实施方式中，步骤(b)中所用的APC与步骤(c)中所用的APC的比率为约1.1： 1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1、2：1、2.1：1、2.2：1、2.3：1、2.4： 1、2.5：1、2.6：1、2.7：1、2.8：1、2.9：1、3：1、3.1：1、3.2：1、3.3：1、3.4：1、3.5：1、3.6：1、3.7： 1、3.8：1、3.9：1、4：1、4.1：1、4.2：1、4.3：1、4.4：1、4.5：1、4.6：1、4.7：1、4.8：1、4.9：1或5：1， 优选为约1至2。 在一些实施方式中，第一TIL群获自核心活检物。 在一些实施方式中，核心活检物从选自下组的肿瘤中获得：黑色素瘤肿瘤、卵巢癌 肿瘤、宫颈癌肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤、肺癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、由人乳 头状瘤病毒引起的癌症的肿瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))肿瘤、胶质母细胞瘤 肿瘤、胃肠道癌肿瘤和肾癌肿瘤。 本发明还提供了包含使用本文所述方法扩增的TIL的组合物。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂(cryopreservant)。 在一些实施方式中，冻存剂包括二甲基亚砜。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂，所述冻存剂包括二甲基亚砜， 所述等渗剂包括氯化钠、葡萄糖酸钠和乙酸钠。 在一些实施方式中，组合物还包含冻存剂和等渗剂，所述冻存剂包括二甲基亚砜 和右旋糖酐40，所述等渗剂包括氯化钠、葡萄糖酸钠和乙酸钠。 在一些实施方式中，包含TIL的组合物装在无菌输液袋中提供。 附图说明 图1：概述了步骤A至F的示例性过程2A图。 图2：过程2A的过程流程图。 图3：显示了冷冻保存的TIL示例性生产过程(约22天)的实施方式的图。 21 CN 111601883 A 说 明 书 11/214 页 图4：显示了过程2A(22天的TIL生产过程)的实施方式的图。 图5：过程1C和过程2A的示例性实施方式的步骤A至F的比较表。 图6：过程1C的实施方式和过程2A的实施方式的详细比较。 图7：概述了小活检物扩增过程的步骤A至F的示例性小活检图。 图8：由取自胰腺癌患者(P7015)的核心活检物扩增的活细胞的图像。A)用IL-2处 理的核心活检物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物。 图9：从胰腺核心活检物扩增的TIL的FACS分析。A)由用IL-2处理的核心活检物扩 增得到的T细胞为CD4 和CD8 。B)由用IL-2处理的核心活检物扩增得到的CD8 T细胞为 CD107a 。C)由用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物扩增得到的T细胞为CD4 和 CD8 。D)由用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的核心活检物扩增得到的CD8 T细胞为CD107a 。 图10：由宫颈癌患者(C2005)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)用IL-2 处理的细针抽吸物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的细针抽吸物。 图11：由肺癌患者(L4032)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)用IL-2处 理的细针抽吸物；以及B)用IL-2、IL-15和IL-21的组合处理的细针抽吸物。C)作为对照，肺 肿瘤碎片用IL-2培养并扩增产生CD4 和CD8 T细胞。 图12：使用快速扩增方案进一步扩增来自肺癌患者(L4032)的FNA样品的TIL。A)对 由抽吸物扩增的TIL进行快速扩增之后的总细胞数，该抽吸物先用单独的IL-2处理、用IL- 2、IL-15和IL-21的组合处理或先用IL-2、IL-15和IL-21的组合然后用单独的IL-2处理。B) CD4 和CD8 T细胞存在于用Il-2处理的扩增TIL群中。 图13：由肺癌患者(L4033)的细针抽吸物扩增得到的TIL的FACS分析。A)来自用IL- 2处理的细针抽吸物的T细胞；以及B)作为对照，来自用IL-2培养的肺肿瘤碎片的T细胞。 图14：使用快速扩增方案进一步扩增由肺癌患者(L4033)的细针抽吸物扩增得到 的TIL。A)对由经IL-2处理的细针抽吸物获得的TIL进行快速扩增之后的总细胞数。 图15：取自卵巢癌患者(OV8011、OV8012和OV8013)的卵巢肿瘤的细针抽吸物的 TIL。用IL-2或IL-2、IL-15和IL-21的组合对细针抽吸物进行培养之后的总细胞数。 图16：由黑色素瘤患者(M1101)的细针抽吸物扩增的TIL的FACS分析。A)来自用IL- 2处理的细针抽吸物的T细胞；以及B)作为对照，来自用IL-2培养的肺肿瘤碎片的T细胞。 图17：通过核心活检获得的源自胰腺肿瘤样品的TIL的表型和功能状态。A)在具有 IL-2的培养基或具有IL-2和细胞培养添加剂的培养基中培养的胰腺肿瘤的结果。B和C)在 用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激之后，在不同培养基(补充IL-2的培养基与补 充添加剂的培养基)中的CD4 细胞和CD8 细胞的CD107a表达的结果。 图18：核心活检物和细针抽吸物的结果汇总表。A)胰腺癌和肺癌样品的结果。B)结 肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌和黑色素瘤样品的结果。 图19：通过细针抽吸活检物获得的源自黑色素瘤样品的TIL的表型和功能状态。A) 0天、11天，18天和21天后细胞培养物的总细胞数。B)源自碎片和抽吸物的细胞的表型分析。 B)用PMA刺激后，源自碎片和抽吸物的细胞的功能分析(CD107a表达)。 图20：显示可由UPMC(匹兹堡大学医学中心)获得的胰腺癌核心活检物扩增TIL的 数据概述。 22 CN 111601883 A 说 明 书 12/214 页 图21：显示了源自胰腺肿瘤的TIL的一般表型的数据。 图22：通过IFN-γ和CD107a测定，由胰核心物的pre-REP和REP分离的TIL是功能性 的。 图23：在低扩增的Pre-REP肺TIL中观察到CD3 /NK细胞群增加。 图24：大多数Pre-REP肺TIL中的CD4/CD8比率高于1。 图25：REP期间，高产量和低产量均观察到相当的倍数扩增。 图26：关于肉瘤(UPMC 58)的数据。 图27：关于宫颈癌(UPMC45)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩增Pre-REP TIL 21 天。 图28：关于ES19001(UPMC46)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩增Pre-REP TIL 21天。 图29：关于硬腭(UPMC 67)和口腔癌(UPMC 68)的数据。在G-REX 10中由4个碎片扩 增Pre-REP TIL 21天。 图30：显示TIL可由UPMC提供的胰腺癌核心活检物扩增的数据概述。 [0200] 图31：胰腺核心活检物：可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7015实验概述和结 果：将一个核心物放入24孔板的一个孔中，总共5个孔。将两个核心物放入两个孔中，但这些 孔中几乎没有生长。用1)IL-2处理三个孔，用2)IL-2/IL-15/IL-21处理两个孔。 [0201] 图32：数据显示由胰腺核心物扩增的大多数细胞是CD4 T细胞和CD8 T细胞，且如 通过CD107a表达(P7015)所测定地是功能性的。P7015实验结果：由胰腺核心活检物扩增的 大多数细胞为T细胞(约80％为CD4 和CD8 )。PMA/I刺激显示CD8 脱粒的能力，如通过 CD107a 表达所示，从而表明这些细胞是功能性的。与单独的IL-2相比，在IL-2/IL-15/IL- 21三重混合物条件下，表达CD107a 的CD8 的百分比更高。 [0202] 图33：胰腺核心活检物：可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7028和P7031pre-REP 实验概述和结果：将11个核心活检物与三重混合物(IL-2/IL-15/IL-21)放在G-Rex10中。在 第12天评估P7028TIL，继续培养直至第19天。细胞计数：第21天＝1.61e6个活细胞；第21天 ＝3.49e7个活细胞。在第12天评估P7028TIL，继续培养直至第27天。细胞计数：第12天＝ 1.52e5个活细胞；第27天：1.14e7个活细胞。 [0203] 图34：胰腺核心活检物：可由经IL-2/IL-15/IL-21处理的来自胰腺癌的核心活检 物和碎片扩增TIL。源自碎片的TIL的收获日为第11天至21天。源自核心物的TIL的收获日为 第21至28天。 [0204] 图35：源自核心物和肿瘤活检物的TIL的表型表征。源自碎片的TIL的收获日为第 11天至21天。源自核心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0205] 图36：源自核心物和肿瘤活检物的TIL的表型表征。 [0206] 图37：与分离自碎片的TIL相似，来自核心活检物的TIL可表达CD107a并分泌IFN γ。 [0207] 图38：A)核心活检扩增程序的示例性过程。对1至2个核心活检物(3个胰腺、4个黑 色素瘤、1个乳腺和1个卵巢)进行示例性处理，包括在第3天添加OKT3 饲养细胞。胰腺核心 物扩增 /-IL-15和IL-21(REP1和REP2；即，第一次扩增和第二次扩增)。处理卵巢核心物 /- OX40(BMS)(n＝1)。所有TIL均进行第二次REP(第二次扩增)。B)核心活检扩增程序的示例性 23 CN 111601883 A 说 明 书 13/214 页 过程。1至2个核心活检物需经历其中包括在第3天添加OKT3 饲养细胞的过程。 [0208] 图39：胰腺核心活检扩增程序的汇总表。 [0209] 图40：关于胰腺核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0210] 图41：黑色素瘤核心活检扩增程序的汇总表。 [0211] 图42：关于黑色素瘤核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0212] 图43：REP1和REP2(即，第一次扩增和第二次扩增)的耗竭标志物和活化标志物的 表型表达相似。 [0213] 图44：与来自碎片的Gen2(即，过程2A)来源的TIL相比，在第3天向核心物添加OKT3 饲养细胞未显著改变TIL的表型。 [0214] 图45：乳腺核心(breast core)和卵巢核心(ovarian core)活检扩增程序的汇总 表。 [0215] 图46：关于乳腺(左)和卵巢(右图)核心活检扩增的细胞数量的数据。 [0216] 图47：实验表明可由胰腺癌的核心活检物扩增TIL。P7028和P7031pre-REP的实验 概述和结果。将核心活检物与三重混合物(IL-2/IL-15/IL-21)一起放入G-Rex 10。在第12 天评估P7028TIL，继续培养直至第19天。细胞计数：第12天＝1.61×106个活细胞；第21天＝ 3.49×107个活细胞。在第12天评估P7030TIL，继续培养直至第27天。细胞计数：第12天＝ 1.52×105个活细胞；第27天＝1.14×107个活细胞。 [0217] 图48：可由经IL-2/IL-15/IL-21处理的来自胰腺癌的核心活检物和碎片扩增TIL。 该图显示了碎片和核心物的细胞扩增数。来自碎片的TIL的收获日为第11天至21天。来自核 心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0218] 图49：源自核心物和碎片的TIL在表型上相似。来自碎片的TIL的收获日为第11天 至21天。来自核心物的TIL的收获日为第21至28天。 [0219] 图50：当比较来自核心物和碎片的TIL时，“耗竭标志物”差异表达。 [0220] 图51：与从碎片分离的TIL相似，来自核心活检物的TIL可表达CD107a并分泌IFN γ。 [0221] 图52：无论初始培养条件(REP1；第一次扩增)如何，TC(三重混合物；IL-2/IL-15/ IL-21)未显著改变REP2(第二次扩增)中胰腺核心物的总细胞数。 [0222] 图53：TC(三重混合物；IL-2/IL-15/IL-21)未显著改变胰腺核心物的REP2(第二次 扩增)中CD4/CD8比率或记忆亚群。 [0223] 图54：在胰腺核心物的所有处理条件下，来自REP2(第二次扩增)的CD4群和CD8群 的CD107a相似。 [0224] 图55：无论胰腺核心物的REP2(第二次扩增)处理条件如何，IFNγ分泌均相似。 [0225] 图56：与胰腺核心物的pre-REP条件相比，在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和 饲养细胞未显著改变表型表达。 [0226] 图57：在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和饲养细胞未显著改变胰腺核心物中 “耗竭标志物”的表型表达。 [0227] 图58：在第3天(REP1；第一次扩增)添加OKT3和饲养细胞未显著改变胰腺核心物中 活化标志物的表型表达。 [0228] 图59：胰腺核心物的pre-REP、REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中CD4群和 24 CN 111601883 A 说 明 书 14/214 页 CD8群的CD107a相似。 [0229] 图60：与胰腺核心物的REP1(第一次扩增)相比，REP2(第二次扩增)中IFNγ的分泌 减少。 [0230] 图61：在REP2(第二次扩增)中，TCM(中枢记忆T细胞)群增加，而TEM(效应记忆T细 胞)减少；但在黑色素瘤中，CD27和CD28未改变。TEMRA：重新表达CD45RA的末端分化效应记 忆细胞。TSCM：T记忆干细胞(Stem memory T cell)。 [0231] 图62：黑色素瘤核心物REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中的IFNγ和 CD107a相似。 [0232] 图63：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8表型标志物的数据。 [0233] 图64：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8表型标志物的数据。 [0234] 图65：显示黑色素瘤碎片vs黑色素瘤核心物的CD4和CD8的CD107a水平的数据。 [0235] 图66：OX40处理增加了卵巢核心物中CD8 细胞的百分比。 [0236] 图67：OX40处理的卵巢核心物的CD107a表达和IFNγ分泌相似。 [0237] 图68：乳腺核心物的REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中增加的TCM以及耗 竭标志物和活化标志物的差异表达。 [0238] 图69：乳腺核心物的REP1(第一次扩增)和REP2(第二次扩增)中CD107a和IFNγ相 似。 [0239] 图70：示例性肿瘤核心活检TIL扩增程序的示意图。 [0240] 图71：经OKT3 饲养细胞处理的源自胰腺核心物的TIL经再刺激后分泌IFNγ。 [0241] 图72：源自黑色素瘤核心物的TIL经再刺激后表达CD107a并分泌IFNγ。 [0242] 图73：由乳腺核心活检物和卵巢核心活检物扩增TIL。 [0243] 图74：REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的源自乳腺核心物的TIL的终产物表型与 REP1期间仅用IL-2处理的核心物类似。 [0244] 图75：REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的源自乳腺核心物的TIL的终产物表型与 REP1期间仅用IL-2处理的核心物类似。 [0245] 图76：与REP1期间仅用IL-2处理的核心相比，REP1期间经OKT3 饲养细胞处理的乳 腺核心物的IFNγ分泌表达增加。 [0246] 图77：REP2期间OX40处理增加了卵巢核心物的CD8 细胞的百分比。 [0247] 图78：两个REP期间的OX40处理改变了REP2中PD-1、KLRG1和CD25的表达。 [0248] 图79：终产物(REP2)中经OX40处理的卵巢核心物的IFNγ分泌略高。 [0249] 图80：经OX40处理的卵巢核心物的CD107a表达。 [0250] 图81：两个REP期间的OX40处理改变了与T细胞“年轻(youth)”有关的标志物的表 达。 [0251] 图82：两个REP期间的OX40处理略微改变了REP2中PD-1、KLRG1和CD25的表达。 [0252] 图83：乳腺核心物的REP1和REP2中耗竭标志物和活化标志物的差异表达。 [0253] 图84：乳腺核心物的REP1和REP2中CD107a和IFNγ相似。 [0254] 图85A-85B：A)显示了2A过程(约22天的过程)和用于生产TIL的小活检Gen 3过程 的一个实施方式(约17天至24天的过程)的比较。B)概述了步骤A至F(约17天至24天的过程) 的Gen 3示例流程图。 25 CN 111601883 A 说 明 书 15/214 页 [0255] 图86：提供了GEN 2(过程2A)vs GEN 3的可比性的实验流程图。 [0256] 图84A-87C：A)L4054-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的表型表征。B)L4055-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的表型表征。C)M1085T-Gen 2过程和Gen 3过程的TIL产物的 表型表征。 [0257] 图88A-88C：A)L4054-GEN 2过程和GEN 3过程的TIL产物的记忆标志物分析。B) L4055-GEN 2过程和GEN 3过程的TIL产物的记忆标志物分析。C)M1085T-GEN2过程和GEN 3 过程的TIL产物的记忆标志物分析。 [0258] 图89：L4054活化标志物和耗竭标志物(A)对CD4 门控和(B)对CD8 门控。 [0259] 图90：L4055活化标志物和耗竭标志物(A)对CD4 门控和(B)对CD8 门控。 [0260] 图91：IFNγ产量(pg/mL)：Gen 2过程和Gen 3过程的(A)L4054、(B)L4055和(C) M1085T：此处表示的每个条形是刺激、无刺激和培养基对照的IFNγ水平的平均值 SEM。在 450nm处测得光密度。 [0261] 图92：细胞培养上清液中IL-2浓度的ELISA分析：(A)L4054和(B)L4055。此处表示 的每个条形是用过的培养基的IL-2水平的平均值 SEM。在450nm处测得光密度。 [0262] 图93：用过的培养基中葡萄糖和乳酸酯的定量(g/L)：(A)葡萄糖和(B)乳酸酯：在 两个肿瘤系和两个过程中，整个REP期间观察到葡萄糖减少。相反，如所预期的，观察到乳酸 酯增加。GEN 2和GEN 3之间，葡萄糖减少和乳酸酯增加均相当。 [0263] 图94：A)L4054和L4055的用过的培养基中L-谷氨酰胺的定量。B)L4054和L4055的 用过的培养基中Glutamax的定量。C)L4054和L4055的用过的培养基中氨的定量。 [0264] 图95：端粒长度分析：使用DAKO试剂盒，相对端粒长度(RTL)值指示了对照细胞系 (1301白血病细胞系)中每个染色体/基因组的端粒荧光的GEN 2和GEN 3过程中每个染色 体/基因组的平均端粒荧光。 [0265] 图96：在Gen 2过程和Gen 3过程下，L4054和L4055的TIL终产物的独特CDR3序列分 析。条柱显示了在GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14至16天)收获日收集的1×106 个细胞中鉴定出的独特TCR B克隆型的数量。基于样品中独特肽CDR的数量，与Gen 2相比， Gen 3显示出更高的克隆多样性。 [0266] 图97：L4054IL收获的最终细胞产物(GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14 至16天))的独特CDR3序列的频率。 [0267] 图98：L4055TIL收获的最终细胞产物(GEN 2(例如第22天)和GEN 3过程(例如第14 至16天))的独特CDR3序列的频率。 [0268] 图99：在Gen 2过程和Gen 3过程下，L4054和L4055的TIL终产物的多样性指数。香 农熵多样性指数(Shanon entropy diversity index)是用于比较的更可靠和更通用的指 标。Gen 3L4054和L4055显示出比Gen 2略高的多样性。 [0269] 图100：表37中所示的第7天-开始Gen 3REP的细胞计数的原始数据(参见下文实施 例14)。 [0270] 图101：表37中所示的第11天-开始Gen 2REP和Gen 3按比例扩增(Scale Up)的细 胞计数的原始数据(参见下文实施例14)。 [0271] 图102：表38中所示的第16天-Gen 2按比例扩增和Gen 3收获(例如第16天)的细胞 计数的原始数据(参见下文实施例14)。 26 CN 111601883 A 说 明 书 16/214 页 [0272] 图103：表38中所示的第22天-Gen 2收获(例如第22天)的细胞计数的原始数据(参 见下文实施例14)。对于L4054Gen 2，将LOVO后的计数外推至4个烧瓶，因为这是研究总数。 污染了1个烧瓶，进行外推得出总计＝6.67×1010。 [0273] 图104：图87A、87A和87B所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0274] 图105：图87C和87C所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0275] 图106：图89和90所示的流式细胞术结果的原始数据。 [0276] 图107：图91所示的L4054样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0277] 图108：图91所示的L4055样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0278] 图109：图91所示的M1085T样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。 [0279] 图110：图92所示的IL-2ELISA测定结果的原始数据。 [0280] 图111：图93和94所示的代谢底物和代谢分析结果的原始数据。 [0281] 图112：图95所示的相对端粒长度分析结果的原始数据。 [0282] 图113：图96和99所示的独特CD3序列和克隆多样性分析结果的原始数据。 [0283] 图114：显示了各种Gen 2(2A过程)与Gen 3.1过程实施方式的比较。 [0284] 图115：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3过程的实施方式的各种特征的表。 [0285] 图116：Gen 3过程(称为Gen 3.1)的实施方式的培养基条件的概述。 [0286] 图117：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3过程的实施方式的各种特征的表。 [0287] 图118：比较了Gen 2和Gen 3.0过程的实施方式的各种特征的表。 [0288] 图119：提供了所述扩增过程的各个实施方式的培养基使用的表。 [0289] 图120：表型比较：该过程的Gen 3.0和Gen 3.1实施方式显示了相当的CD28、CD27 和CD57表达。 [0290] 图121：Gen 3终产物的IFNγ产量更高。用培养的冷冻上清液评估IFNγ分析(通过 ELISA)以比较两个过程。对于用包被的抗-CD3平板过夜刺激的每个肿瘤，使用新鲜的TIL产 物进行每个Gen 2(例如第22天)和Gen 3过程(例如第16天)。每个条形代表刺激、未刺激和 培养基对照的IFNγ水平。 [0291] 图122：上图：TIL终产物的独特CDR3序列分析：条柱显示了由Gen 2(例如第22天) 和Gen 3过程(例如第14至16天)收集的1×106个细胞鉴定出的独特的TCR B克隆型的数量。 基于样品中独特肽CDR的数量，与Gen 2相比，Gen 3显示出更高的克隆多样性。下图：TIL终 产物的多样性指数：香农熵多样性指数是用于比较的更加可靠通用的度量。Gen 3显示出略 高于Gen 2的多样性。 [0292] 图123：Gen 3和Gen 2终产物共享199个序列，对应于Gen 2的独特CDR3序列的前 80％与Gen 3终产物共享97.07％。 [0293] 图124：Gen 3和Gen 2终产物共享1833个序列，对应于Gen 2的独特CDR3序列的前 80％与Gen 3终产物共享99.45％。 [0294] 图125：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方式的示意图。 [0295] 图126：使用Gen 3扩增平台由造血系统恶性肿瘤扩增TIL的方法的示例性实施方 式的示意图。 [0296] 图127：提供的数据显示，与Gen2相比，在第3天向核心物添加OKT3 饲养细胞并未 显著改变TIL的表型，表明TIL是健康TIL。 27 CN 111601883 A 说 明 书 17/214 页 [0297] 图128：提供的数据显示，黑色素瘤核心物来源的TIL的耗竭标志物和活化标志物 的表达遵循与胰腺核心来源的TIL相似的趋势。在REP1和REP2中，IL-2和三重混合物的表型 表达并无差异。 [0298] 图129：提供了关于由肺核心活检物扩增TIL的数据。 [0299] 图130：提供的数据显示，在第0天vs第3天(OKT3 饲养细胞)处理的肺核心物中观 察到相似的表型概况。 [0300] 图131：提供的数据显示，在第3天用OKT3和饲养细胞处理的核心物中活化标志物 和驻留T细胞标志物的表型表达增强。 [0301] 图132：如通过响应于非特异性刺激的IFNγ分泌和CD107a动员(mobilization)所 确定的，来自肺核心物的TIL是功能性的。 [0302] 图133：与第0天处理的TIL相比，第3天处理的肺核心物的CD8 TIL是寡克隆的。 序列表说明 [0303] SEQ ID NO：1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。 [0304] SEQ ID NO：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。 [0305] SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。 [0306] SEQ ID NO：4是阿地白介素的氨基酸序列。 [0307] SEQ ID NO：5是重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。 [0308] SEQ ID NO：6是重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。 [0309] SEQ ID NO：7是重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。 [0310] SEQ ID NO：8是重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。 [0311] SEQ ID NO：9是人4-1BB的氨基酸序列。 [0312] SEQ ID NO：10是鼠4-1BB的氨基酸序列。 [0313] SEQ ID NO：11是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(utomilumab) (PF- 05082566)的重链。 [0314] SEQ ID NO：12是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链。 [0315] SEQ ID NO：13是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链可变 区(VH)。 [0316] SEQ ID NO：14是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链可变 区(VL)。 [0317] SEQ ID NO：15是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR1。 [0318] SEQ ID NO：16是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR2。 [0319] SEQ ID NO：17是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR3。 [0320] SEQ ID NO：18是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。 [0321] SEQ ID NO：19是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。 [0322] SEQ ID NO：20是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。 [0323] SEQ ID NO：21是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的 重链。 [0324] SEQ ID NO：22是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。 [0325] SEQ ID NO：23是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区 28 CN 111601883 A 说 明 书 18/214 页 (VH)。 [0326] SEQ ID NO：24是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区 (VL)。 [0327] SEQ ID NO：25是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。 [0328] SEQ ID NO：26是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。 [0329] SEQ ID NO：27是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。 [0330] SEQ ID NO：28是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。 [0331] SEQ ID NO：29是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。 [0332] SEQ ID NO：30是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。 [0333] SEQ ID NO：31是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。 [0334] SEQ ID NO：32是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0335] SEQ ID NO：33是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0336] SEQ ID NO：34是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0337] SEQ ID NO：35是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0338] SEQ ID NO：36是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0339] SEQ ID NO：37是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0340] SEQ ID NO：38是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0341] SEQ ID NO：39是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0342] SEQ ID NO：40是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0343] SEQ ID NO：41是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0344] SEQ ID NO：42是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。 [0345] SEQ ID NO：43是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0346] SEQ ID NO：44是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0347] SEQ ID NO：45是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。 [0348] SEQ ID NO：46是4-1BB配体(4-1BBL)的氨基酸序列。 [0349] SEQ ID NO：47是4-1BBL多肽的可溶部分。 [0350] SEQ ID NO：48是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。 [0351] SEQ ID NO：49是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。 [0352] SEQ ID NO：50是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。 [0353] SEQ ID NO：51是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。 [0354] SEQ ID NO：52是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。 [0355] SEQ ID NO：53是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。 [0356] SEQ ID NO：54是人OX40的氨基酸序列。 [0357] SEQ ID NO：55是鼠OX40的氨基酸序列。 [0358] SEQ ID NO：56是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(tavolixizumab)(MEDI- 0562)的重链。 [0359] SEQ ID NO：57是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链。 [0360] SEQ ID NO：58是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链可变区 (VH)。 29 CN 111601883 A 说 明 书 19/214 页 [0361] SEQ ID NO：59是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链可变区 (VL)。 [0362] SEQ ID NO：60是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。 [0363] SEQ ID NO：61是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。 [0364] SEQ ID NO：62是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。 [0365] SEQ ID NO：63是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。 [0366] SEQ ID NO：64是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。 [0367] SEQ ID NO：65是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。 [0368] SEQ ID NO：66是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。 [0369] SEQ ID NO：67是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。 [0370] SEQ ID NO：68是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。 [0371] SEQ ID NO：69是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。 [0372] SEQ ID NO：70是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。 [0373] SEQ ID NO：71是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。 [0374] SEQ ID NO：72是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。 [0375] SEQ ID NO：73是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。 [0376] SEQ ID NO：74是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。 [0377] SEQ ID NO：75是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。 [0378] SEQ ID NO：76是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。 [0379] SEQ ID NO：77是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。 [0380] SEQ ID NO：78是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。 [0381] SEQ ID NO：79是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。 [0382] SEQ ID NO：80是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。 [0383] SEQ ID NO：81是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。 [0384] SEQ ID NO：82是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。 [0385] SEQ ID NO：83是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。 [0386] SEQ ID NO：84是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。 [0387] SEQ ID NO：85是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。 [0388] SEQ ID NO：86是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。 [0389] SEQ ID NO：87是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。 [0390] SEQ ID NO：88是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。 [0391] SEQ ID NO：89是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。 [0392] SEQ ID NO：90是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。 [0393] SEQ ID NO：91是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。 [0394] SEQ ID NO：92是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。 [0395] SEQ ID NO：93是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。 [0396] SEQ ID NO：94是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。 [0397] SEQ ID NO：95是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。 [0398] SEQ ID NO：96是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。 30 CN 111601883 A 说 明 书 20/214 页 [0399] SEQ ID NO：97是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。 [0400] SEQ ID NO：98是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。 [0401] SEQ ID NO：99是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。 [0402] SEQ ID NO：100是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。 [0403] SEQ ID NO：101是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。 [0404] SEQ ID NO：102是OX40配体(OX40L)的氨基酸序列。 [0405] SEQ ID NO：103是OX40L多肽的可溶部分。 [0406] SEQ ID NO：104是OX40L多肽的替代性可溶部分。 [0407] SEQ ID NO：105是OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。 [0408] SEQ ID NO：106是OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。 [0409] SEQ ID NO：107是OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。 [0410] SEQ ID NO：108是OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。 [0411] SEQ ID NO：109是OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。 [0412] SEQ ID NO：110是OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。 [0413] SEQ ID NO：111是OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。 [0414] SEQ ID NO：112是OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。 [0415] SEQ ID NO：113是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0416] SEQ ID NO：114是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0417] SEQ ID NO：115是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0418] SEQ ID NO：116是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0419] SEQ ID NO：117是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0420] SEQ ID NO：118是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0421] SEQ ID NO：119是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0422] SEQ ID NO：120是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0423] SEQ ID NO：121是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0424] SEQ ID NO：122是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0425] SEQ ID NO：123是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0426] SEQ ID NO：124是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。 [0427] SEQ ID NO：125是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。 [0428] SEQ ID NO：126是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
