技术摘要：
本发明提供一种拯救油梨未成熟胚的方法，该方法包括：收集未成熟的油梨杂交果实，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；根据合子胚的成熟度，选择不同的培养基中促使合子胚的成熟；油梨种胚发芽后，在光照条件下长成正常的植株。本发明提供了一种油梨未成熟胚的体外  全部
背景技术：
油梨杂交育种是创造遗传变异、改良遗传特性，培育优良植物新品种的主要技术。 通过油梨的种间杂交，可以将同一物种内的两个或多个优良性状集中在一个新品种中。另 外，种间杂交还可以产生杂种优势，获得比亲本品种更强或表现更好的新品种。 然而，油梨幼果具有很高的脱落率。利用杂交方法进行杂交，杂交的果实会大量落 果，能正常在树上发育的很少，导致油梨杂交培育材料巨大丢失，这也是油梨杂交育种中存 在的重大难题。本发明就这一难题进行了研究，提出一种解决脱落的杂交油梨果实合子胚 拯救成熟的方法，从而有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交 后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提 供关键技术。
技术实现要素：
针对现在技术中存在的问题，本发明提供一种利用未成熟胚进行体外培养，从脱 落的油梨果实中培养出成熟的油梨种子胚胎的方法。拯救后的油梨种子可以发芽并生长成 正常的杂交油梨植株。 在本发明中，“种胚”、“合子胚”、“胚体”均是指本发明的方法所拯救的核心对象， 在本发明的语境下，这些术语可以互换。在不同的具体语境下，采用不同的术语。 本发明的拯救未成熟的油梨种胚方法使用到的培养基包括： (1)基础培养基 基础培养基是种胚萌发的基础营养液，由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组 成； (2)萌发培养基 萌发培养基是种胚萌发的营养液，由基础培养基 6-苄胺基嘌呤(6-BA) 琼脂粉 蔗糖组成； (3)陪护培养基 对于成熟度低于80％的油梨种胚，由于成熟度低，因此需要采用陪护培养基进行 人工促进种胚的生长；陪护培养基由全强度或半强度的基础培养基 酪蛋白水解物或谷氨 酸 琼脂粉 蔗糖组成。 如图1所示，本发明的方法包括以下步骤： (1)外植体前处理 收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚； 根据实践经验，判断合子胚的成熟度；对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接 8 CN 111543319 A 说　明　书 2/11 页 萌发培养；对于成熟度为80％以下的合子胚，则先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后 再进行萌发培养； (2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基； 其中，基础培养基的配方为： 陪护培养基的配方a、b、c、d、e和f的配方如下： a.半强度的基础培养基 300～500mg/L酪蛋白水解物 9 CN 111543319 A 说　明　书 3/11 页 8～12％椰子水 8～12％蔗糖 1～3g/L琼脂粉；以及 b.半强度的基础培养基 300～500mg/L谷氨酰胺 8～12％椰子水 8～12％蔗糖 1-3g/L琼脂粉 c.半强度的基础培养基 300-500mg/L酪蛋白水解物 8-12％椰子水 4-6％蔗糖 2-4g/L琼脂粉；以及 d.半强度的基础培养基 300-500mg/L谷氨酰胺 8-12％椰子水 4-6％蔗糖 2-4g/L琼脂粉； e.基础培养基 300-500mg/L酪蛋白水解物 8-12％椰子水 2-4％蔗糖 4-6g/L琼脂粉；以及 f.基础培养基 300-500mg/L谷氨酰胺 8-12％椰子水 2-4％蔗糖 4-6g/L琼脂粉； 分别根据陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方，将椰子水以外的各个成分加到容器 中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤 并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f； 萌发培养基的配方为： 基础培养基 2.0-4.0μM  6-苄胺基嘌呤(6-BA) 4-8g/L琼脂粉 2.5-3.5％蔗糖； (3)初始陪护培养基的选择 根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方； 对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培 10 CN 111543319 A 说　明　书 4/11 页 养基； 对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪 护培养基； 对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养 基。另外，对于授粉后200天之后的种胚，是比较成熟的种胚，也可以采用萌发培养基直接进 行萌发培养； (4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换 在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养(这个时间的陪护培养 也可以称为“初级陪护培养”)；当将合子胚培养到鱼雷期时，更换为陪护培养基c或d进行陪 护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“一级陪护培养”)；在合子胚培养至成熟期时更换 为陪护培养基e或f进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“陪护培养”)。 将合子胚培养至成熟期的时间设定在10周内，在这10周内，无论是合子胚属于哪 个成熟度，10周内基本都能通过陪护培养而培养至成熟期。随着合子胚成熟度的提高，需要 不断更换陪护培养基。一般地，在针对某个成熟度的合子胚采用相应的陪护培养基进行培 养，随着成熟度的提高，每隔3-4周后更换用于更高成熟度的陪护培养基。例如，在前心形采 用陪护培养基a进行陪护培养，经过3-4周后，合子胚发展到了鱼雷期，此时，将陪护培养基 更换为陪护培养基c进行进一步的陪护培养。 经陪护培养，合子胚已发展到成熟期，然后进行萌发培养； 未成熟合子胚的陪护培养在黑暗条件下进行。 (5)萌发培养 将上面陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养，以维 持合子胚的生长；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。在萌发期间， 通过在陪护培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽；在15周期间进行发芽，大约每隔3周更换 萌发培养基。 根据本发明的方法，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。 根据本发明的方法，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后 在无菌蒸馏水中漂洗三次；优选地，所述0.5v/v％次氯酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。 根据本发明的方法，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为： 基础培养基 2.22μM  6-BA 6g/L琼脂粉 2.5-3.5％蔗糖； 其中，所述基础培养基的配方为： 11 CN 111543319 A 说　明　书 5/11 页 根据本发明的方法，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下： a.半强度的基础培养基 400mg/L酪蛋白水解物 10％椰子水 10％蔗糖 2g/L琼脂粉；以及 b.半强度的基础培养基 12 CN 111543319 A 说　明　书 6/11 页 400mg/L谷氨酰胺 10％椰子水 10％蔗糖 2g/L琼脂粉 c.半强度的基础培养基 400mg/L酪蛋白水解物 10％椰子水 5％蔗糖 3g/L琼脂粉；以及 d.半强度的基础培养基培养基 400mg/L谷氨酰胺 10％椰子水 5％蔗糖 3g/L琼脂粉； e.基础培养基 400mg/L酪蛋白水解物 10％椰子水 3％蔗糖 5g/L琼脂粉；以及 f.基础培养基 400mg/L谷氨酰胺 10％椰子水 3％蔗糖 5g/L琼脂粉。 在根据发明方法的步骤(3)中，对于授粉后100天内的种胚，若选择初始陪护培养 效果不佳或发育不好的，则在将种子剥去种皮、消毒后，采用前培养基使种子在25℃±1℃ 的温度下维持生长，在维持生长期间进行16小时的光照射(如图2所示)，待种子恢复正常生 长时，按照上述步骤继续未成熟胚的拯救； 其中，前培养基的配方为： 半强度的基础培养基 2.0-2.5μM  6-苄胺基嘌呤 4-8g/L琼脂粉 2.5-3.5％蔗糖。 在本发明的方法的步骤(3)中，采用酸将培养基的pH调节至5.74。优选地，所述酸 试剂为盐酸。 在本发明的方法的步骤(3)中，所述灭菌的条件为：在121℃和0.1MPa下高压灭菌 15-20分钟。 在本发明的方法的步骤(5)中，所述光照培养的条件为：通过Grolux灯管照射；优 选地，照射强度为40mmol.m-2.s-1。 13 CN 111543319 A 说　明　书 7/11 页 对于胚成熟度为80-100％之间的合子胚，一般无需拯救种胚，可以将成熟度为80- 100％的种胚直接放入萌发培养基中进行萌发培养。 本发明提供了一种油梨未成熟胚的体外培养拯救技术，当处于不同发育阶段的合 子胚在体外条件下诱导成熟，成熟后诱导胚萌发，形成健康植株的技术。本发明的技术可以 提高杂交油梨种子的回收率，减少杂交成果的浪费。 附图说明 图1是本发明方法的一种实施方式的流程示意图； 图2是本发明方法的另一种实施方式的流程示意图。