技术摘要：
本发明公开了一种人工泪液及其制备方法，属于药学领域，该人工泪液，包含0.0005‑0.005wt％的人脐带间充质干细胞外泌体；本发明利用人脐带间充质干细胞来源的exosome制备的人工泪液作为药物局部注射大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型，实验证明，含有exosome的人  全部
背景技术：
在信息化时代的今天，计算机成为人们工作和学习中必不可少的工具。然而有科 学研究表明，如果每天在电脑面前工作长达三小时以上，则90％的人会出现眼睛发干、疲 劳、注意力难以集中等干眼症的特征。 人的双眼，特别是眼角膜部分，经常依靠泪腺供给水分，通过眨眼，使泪水变成一 层“泪片”分散到眼角膜，保持眼睛舒服。所谓干眼病可以说是一种电脑视力综合症，是指由 于眼泪的减少或者泪腺功能下降，导致眼睛表现出微小伤痕的一种症状。干眼病的一般症 状是眼睛有干涩、灼痛感，眼屎较多；眼酸、眼痒、怕光和视力减退。其他症状还有头痛、烦 躁、疲劳、注意力难以集中，严重时会发生角膜软化穿孔，在检查时可以看到有眼结膜充血。 目前人工泪液替代眼泪成为干眼病治疗的重要手段。国内外也有产品上市，如怡然、爱丽、 润洁、润舒、贝复舒(含重组人成纤维生长因子)、泪然等。但是大多数人工泪液需要频繁使 用，多次点滴，不易在眼表面形成液膜，所以开发便捷高效的人工泪液，具有潜在的社会效 益和经济效益。 目前已知间充质干细胞(MSC)在治疗各种组织损伤以及免疫性疾病中发挥作用。 我们也证明，MSC在包括视网膜缺血再灌注、糖尿病视网膜病变、葡萄膜视网膜炎、视网膜变 性以及视网膜损伤等多种眼科疾病模型中具有治疗作用。MSC可以从数种成人组织(包括骨 髓、脂肪组织、脐带血)分离，并离体扩充。然而，由于MSC细胞产品保存和运输困难，存在移 植存活率低及长期临床应用可能存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，因此，寻 找一种操作简单、安全有效的基于MSC的非细胞疗法显得十分重要。 外泌体(exosome)是一种提取自细胞培养基上清的膜性囊泡，含有其来源细胞的 胞膜和胞质蛋白成分，因此它较易与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将一个细胞的胞膜及 胞质蛋白传递给另一个细胞，在不同细胞间进行信息传递。此外，许多细胞包括MSC分泌的 外泌体还包含着能够在细胞间进行转移的RNA(mRNA及microRNAs)，通过在细胞间水平转移 方式激活靶细胞产生一系列生物学效应。因此，外泌体在细胞微环境中具有十分重要的作 用。 人体天然泪液是由人体泪腺等器官分泌的一种透明液体，由无机盐、多糖、蛋白、 脂质等多种物质组成，具有屏障、抑菌、杀菌及免疫调节等多种功能，对于保护眼球、营养眼 表组织及完善视觉功能等方面起着重要作用。目前市场上针对多种原因引起的泪液分泌不 足型干眼症的人工泪液产品，以基本的补充液体，保湿为主，产品本身有成分单一、低渗等 特点，这些产品虽然能暂时缓解眼睛干燥不适，但同时也会对干眼症眼表本身就偏低的多 种泪液成分再次造成稀释，如泪液中的无机盐，脂质转运蛋白，溶菌酶，乳铁蛋白等，使眼球 表面的泪膜更加不稳定，杀菌及免疫调节功能再次下降。 3 CN 111588736 A 说　明　书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种人工泪液及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问 题，该人工泪液用于补充和治疗干眼症引起的眼部不适症状，同时它对自身免疫性葡萄膜 炎、结膜炎、角膜炎和角膜溃疡等各种眼病也有一定的治疗效果。 为实现上述目的，本发明提供了如下方案： 本发明提供一种人工泪液，包含0.0005-0 .005wt％的人脐带间充质干细胞外泌 体。 进一步地，所述人工泪液还包括1-4wt％的溶菌酶、0.01-1wt％的黄原胶、0.1- 4wt％的水溶性羟丙基壳聚糖及电解质。 上述黄原胶为天然胶质，主要用作增稠剂、乳化稳定剂使用。天然胶体不黏腻，易 溶于水，并乳化变成亲水性粘稠胶体，只需添加少量就可以增加产品粘稠度。黄原胶于1969 年得到美国食品药品管理局(FDA)的批准认证，1975年被美国国家处方集(NF)收载，于2010 年收入中国药典。故该成分安全性较高，可以放心使用。 进一步地，所述电解质包括氯化钠、氯化钾和/或氯化钙。 进一步地，所述氯化钠的量为所述人工泪液的0.8-1wt％，所述氯化钾的量为所述 人工泪液的0.01-0.02wt％，所述氯化钙的量为所述人工泪液的0.035-0.055wt％。 进一步地，所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤： (1)培养足量的人脐带间充质干细胞，在提取干细胞外泌体前48h，PBS清洗细胞， 更换无血清培养基，继续培养48h； (2)收集无血清培养基，300×g离心10min，取上清； (3)2000×g离心10min，取上清； (4)10000×g离心30min，取上清； (5)100000×g离心70min，取沉淀； (6)PBS重悬沉淀，100000×g离心70min，收集沉淀,即得所述人脐带间充质干细胞 外泌体。 进一步地，所述步骤(1)具体为： 在普通血清培养基上培养足够量的人脐带间充质干细胞，培养的温度为36～38 ℃，培养时环境CO2的体积浓度为4％～6％；在提取干细胞外泌体前48h，用PBS清洗细胞，更 换无血清培养基，继续培养48h。 本发明还提供一种上述的人工泪液的制备方法，包括以下步骤： (1)将黄原胶和水溶性羟丙基壳聚糖置于注射用水中充分浸泡溶胀，直至完全溶 解； (2)将电解质直接溶解于注射用水中； (3)将溶菌酶直接溶解于注射用水中； (4)将以上步骤所制备的液体混合后充分搅拌均匀得复合液体； (5)将人脐带间充质干细胞外泌体加入到所述复合液体中； (6)将复合液体加注射用水至足量，充分搅拌均匀后再用磷酸钠盐缓冲剂调节PH 至6-7，得到人工泪液中间品； (7)将所得的人工泪液中间品经抽滤，精滤，通过无菌灌装得成品。 4 CN 111588736 A 说　明　书 3/6 页 通过上述的制备方法，将其制备成一种等渗的、灭菌的、无色透明的粘稠状人工泪 液，主要应用于无泪液患者或用于治疗自身免疫性葡萄膜炎、结膜炎、角膜炎和角膜溃疡； 还可以在眼睛黏膜壁形成一种保护膜，促进溃疡面的愈合并且调节眼睛菌群平衡。 本发明还提供一种上述的人工泪液在制备治疗或预防眼部不适症状的药物中的 应用。 进一步地，所述眼部不适症状包括干眼症引起的眼部不适症状和自身免疫性葡萄 膜炎、结膜炎、角膜炎和角膜溃疡引起的眼部不适症状。 本发明公开了以下技术效果： 本发明利用人脐带间充质干细胞来源的exosome制备的人工泪液作为药物局部注 射大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型，实验证明，含有exosome的人工泪液可促进 角膜溃疡愈合，提高治愈率，减少角膜瘢痕形成，具有免疫抑制作用，能减轻各种原因导致 的视网膜损伤、减轻炎症反应，从而改善视网膜功能，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。 本发明人工泪液的作用原理如下： 1、促进角膜溃疡愈合：黄原胶-羟丙基壳聚糖-外泌体溶胶液能够促进上皮细胞和 血管内皮细胞的生长。黄原胶、壳聚糖和外泌体混合制备的人工泪液可保护角膜上皮细胞 并加速细胞再生，在不影响组织正常生长的情况下，有效地促进创面愈合。 2、止血、消炎、抗菌：人工泪液中含有的黄原胶-壳聚糖-外泌体溶胶液具有止血效 果。对于出血性溃疡性结膜炎具有明显止血作用，形成一种溶胶膜，使眼睛黏膜与外界细 菌、病毒隔离从而有效阻止病原微生物生长，起到物理屏障作用。黄原胶降解产生的寡糖具 有抑菌、抗病毒作用。 3、调节眼睛菌群平衡：黄原胶寡糖能有效地促进眼睛有益菌成倍地增长,且具有 清除羟自由基、抗病毒及免疫调节等作用。黄原胶本身不具有清除自由基功能,但当黄原胶 被降解后,形成的寡糖具有清除羟自由基的功能,因此具有调节眼睛菌群平衡作用。 4、湿润眼睛：人工泪液就是一种调节眼睛菌群，酸碱平衡的外用等渗制品，它能迅 速自动调节眼睛内的酸碱及菌群平衡，促进眼睛粘膜组织的活性氧的吸收，能迅速于眼睛 黏膜表面形成生物膜，从而减少黏膜表面水分流失，达到保湿效果。再者该产品本身是一种 等渗制品，从而保证细胞内外生物膜环境平衡。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。 图1为人工泪液对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎模型的疗效图。