技术摘要：
本发明涉及生物制品领域，特别涉及适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基，包括基础代谢营养物类、微量元素类、维生素类、盐类、病毒增殖促进剂、添加物等。制备方法简单，成本低，便于操作。制得的培养基具有支持MDCK细胞高效生产禽流感病毒的能力，也可为其他细胞系的  全部
背景技术：
禽流感(Bird  Flu或Avian  Influenza）是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病 毒）引起的一种急性传染病，能够感染人类，且人感染禽流感后的死亡率在30％以上，严重 威胁养殖业和人类健康，并给社会带来巨大的经济损失。目前为止禽流感仍未找到理想的 治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最主要预防措施。 禽流感疫苗的传统生产工艺是鸡胚培养法，这种以鸡胚作为生产基质的方式已使 用多年，工艺成熟，但生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡 胚的供应存在很大问题。以细胞作为介质是目前疫苗制备的趋势，与传统的鸡胚生产工艺 相比，细胞培养生产工艺在禽流感爆发时操作更灵活，可快速大规模培养以应对SPF（无特 定病原体）鸡蛋供应不足的问题。目前社会对于禽流感疫苗的需求量很大，但现有细胞培养 生产工艺产能相对低下，因此，提高禽流感病毒在细胞中的扩增效率的研究工作尤为迫切。 在基于细胞培养的禽流感疫苗生产工艺中，培养基是细胞生长和维持活性的基础，也是禽 流感疫苗生产的关键因素。无血清单细胞悬浮培养因其易于放大、工艺稳定、过程可控等优 势，正成为禽流感疫苗生产的主流技术。在目前的研究或生产中，在病毒生产阶段所用维持 培养基大多与用于细胞生长的生长培养基是同一种，但由于病毒生产的特性不同于细胞， 所需的生物合成原料与途径也不同于细胞，这种营养组分的不平衡限制了禽流感病毒的高 效扩增。因此，针对特定的病毒生产阶段筛选适于禽流感病毒生产的维持培养基十分重要。 有大量文献报道MDCK细胞（Madin-Darby  canine  kidney  cells）被广泛用于病毒 的扩增和纯化，因其增殖快，且流感病毒对其感染效率高、不易变异，因此被公认为最适于 甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一。本发明即以MDCK细胞和禽流感病毒为研究对象， 基于MDCK细胞悬浮培养扩增禽流感病毒的生产工艺，提供了一种支持禽流感病毒在MDCK悬 浮细胞中高效扩增的培养基配方，该培养基使病毒产量获得极大提高，具有支持MDCK细胞 高效生产禽流感病毒的能力，也可为其他细胞系的病毒疫苗用培养基开发提供借鉴作用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种适于禽流感病毒高效扩增 的维持培养基，该培养基能支持MDCK细胞高效生产禽流感病毒的能力，促进病毒的扩增效 率。 为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：一种适于禽流感病毒高效扩增的 维持培养基，其特征在于，各组分的浓度以mg/L计为： 基础代谢营养物类：所述基础代谢营养物类为丝氨酸20-250、精氨酸20-250、亮氨酸 20-55、异亮氨酸20-250、丙氨酸1-2、酪氨酸20-55、天冬酰胺2-25、天冬氨酸2-25、盐酸半胱 氨酸5-55、谷氨酸2-50、谷氨酰胺2-50、组氨酸20-250、赖氨酸20-250、苯丙氨酸10-55、苏氨 4 CN 111718906 A 说　明　书 2/6 页 酸5-55、色氨酸20-250、缬氨酸20-250； 核苷酸类：所述核苷酸类为次黄嘌呤2-20、胸苷2-5、腺苷2-5、尿苷2-5、鸟苷2-5； 微量元素类：所述微量元素类为硒0.05-0.1、铬0.05-0.1、钴0.02-0.05、镍0.02-0.05、 锌0.05-0.1、铜0.05-0.1、锰0.05-0.1、钡0.05-0.1、镓0.02-0.05、锂0.05-0.1、锡0.05- 0.1、碘0.05-0.1、钒0.05-0.1、锗0.02-0.05、钼0.02-0.05、硅0.05-0.1、铁0.05-0.1、铷 0.02-0.05、锆0.02-0.05、镉0.05-0.1、铝0.05-0.1； 维生素类：所述维生素类为生物素0.02-0.05、D-泛酸钙0.05-0.1、叶酸0.02-0.05、烟 酰胺0.02-0.05、盐酸吡哆醇0.02-0.05、核黄素0.05-0.1、盐酸硫胺素0.02-0.05、维生素 B12  0.05-0.1、维生素B2  0.05-0.1、肌醇0.05-0.1； 盐类：所述盐类为氯化钠200-500、氯化钾200-500、硫酸铜2-55、硝酸铁2-55、硫酸亚铁 2-55、氯化镁2-55、无水磷酸氢二钠20-250、磷酸二氢钠20-250、亚硒酸钠20-250、硫酸锌2- 55； 病毒增殖促进剂：所述病毒增殖促进剂为胆固醇1-5、卵磷脂0.02-0.05、氯化钙1-5、亚 油酸0.05-0.01、亚麻酸0.05-0.01、月桂酸0.05-0.1、棕榈酸0.05-0.1、维生素E  0.05-0.1、 前列腺素20-55、吐温-80  1-5； 添加物：所述添加物为葡萄糖1000-8000、转铁蛋白2-55、胰岛素2-55、牛血清白蛋白 500-1000、大豆水解物500-1000。 进一步的，所述培养基还包括：酸碱度缓冲剂碳酸氢钠10-1000mg/L； 进一步的，所述培养基还包括：酸碱度指示剂酚红1-20mg/L； 进一步的，所述培养基还包括：剪切力保护剂嵌段式聚醚F68  20-150mg/L； 进一步的，所述培养基还包括：激素地塞米松0.001-0.02mg/L； 进一步的，所述培养基还包括：抗生素两性霉素B  200-500mg/L。 发明人认为，本发明提供的适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基中，基础营养 代谢物包括碳源和氮源，为细胞正常生长、代谢、维持生命提供了物质基础；适当提高丝氨 酸、精氨酸和异亮氨酸、组氨酸、色氨酸等的浓度，满足禽流感病毒的代谢需求，有效促进禽 流感病毒在细胞内扩增。核苷酸类化合物是细胞物质能量代谢所必须的组成分子，同时也 是DNA和RNA等遗传物质合成所需的物质基础；维生素类是细胞代谢必不可少的化合物，众 所周知细胞的各种代谢生长活动都需要维生素的参与，许多维生素可作为辅酶或者辅酶的 组成分子；盐类能调节细胞膜通透性，维持正常酸碱平衡和渗透压，维持细胞良好的形态和 功能，有些无机化合物还构成酶的辅基、维生素、激素、核酸和蛋白质的组成成分，参与多种 重要的生理功能；酸碱度缓冲剂能调控整体系统的酸碱度，使其达到平衡，避免过酸性或过 碱性的环境造成细胞核损伤；酸碱指示剂能实时指示培养液的酸碱度变化，方便及时更换 新鲜培养液、进行细胞传代等操作；添加物则包含血清替代物和为细胞生长提供重要的氨 基酸、短肽等营养物的生命大分子物质，其中添加物中的牛血清白蛋白、转铁蛋白代替血清 功能，提高培养基蛋白含量，保证细胞分化、增殖需要，胰岛素能促进葡萄糖代谢，保证MDCK 细胞的生长活性；剪切力保护剂可削弱生物反应器中因搅拌、通气等机械外力对细胞的损 伤作用；抗生素进一步保证细胞培养环境的安全性，避免细胞污染；病毒增殖促进剂能调控 细胞生理状态、维持病毒活性、促进病毒高效扩增。 上述适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基的制备方法，包括以下步骤： 5 CN 111718906 A 说　明　书 3/6 页 1）制备混合液：将原料干粉用溶剂溶解并混合； 2）调节pH：调节混合液的pH； 3）定容：定容得到适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基。 进一步的，所述原料干粉溶解之前需研磨过筛。 进一步的，所述溶剂选自蒸馏水、去离子水、低级醇中的一种或几种。 进一步的，所述调节pH的溶剂选自氢氧化钠、氨水、氢氧化钾中的一种或几种。 进一步的，所述定容溶剂选自蒸馏水、去离子水中的一种或几种。 作为本发明的进一步改进，上述适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基的制备方 法，优选包括以下步骤： 1）制备混合液：将原料干粉混合后磨粉过50-200目筛，然后将所得细粉于去离子水中 搅拌溶解，得到混合液； 2）调节pH：加入碱液调节混合液的pH至6.0-7.0； 3）定容：去离子水定容得到适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基。 进一步的，所述定容后还包括过滤除菌步骤。 作为本发明的进一步改进，上述适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基的制备方 法，优选包括以下步骤： 1）制备混合液：将原料干粉混合后磨粉过150目筛，然后将所得细粉于10-30℃无热源 去离子水中搅拌溶解，得到混合液； 2）调节pH：加入氨水调节混合液的pH至6.7； 3）定容：去离子水定容得到适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基； 4）过滤出菌：采用0.22μm滤膜过滤除菌。 本发明的有益效果在于： 1、本发明所述适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基不含动物血清；成分明确，可以 保证培养基批次间的一致性； 2、本发明添加的功能性生物材料如牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物 质，提高培养基的蛋白含量，支持MDCK细胞高密度全悬浮培养，细胞成活率达到96%以上，为 禽流感病毒的高效扩增提供基础条件； 3、本发明培养基性质明确，杂质含量降低，简化后期MDCK细胞的分离纯化工艺，有利于 进行细胞生长代谢、病毒扩增方面的研究，同时降低生产成本，显著提高生产过程效率； 4、本发明的制备方法简单，成本低效率高，安全性有保证，有利于大规模生产。 附图说明 图1为MDCK细胞在本发明适于禽流感病毒高效扩增的维持培养基中的形态图； 图2为MDCK细胞培养时活细胞生长随时间的变化图。