技术摘要：
本发明公开了一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法，属于变性蛋白提取技术领域，所述步骤包括，准备实验器具和鲜组织样本，把组织样本在液氮的环境下研磨，使用BPP提取液对研磨后的组织样本进行混合离心处理得到混合液，对混合液进行洗涤，提取蛋白。本发明具有广 全部
背景技术：
蛋白质组学研究中，目前最有效的方法是通过双向电泳技术(2-DE)分离蛋白质， 然后对分离蛋白进行质谱鉴定。由于各种用于双向电泳的蛋白质提取方法，往往因为植物 种类和组织部位的不同而差别很大，因此，提取高质量的蛋白质，成为双向电泳以及后期质 谱鉴定工作中最具挑战性的工作之一。植物组织，特别是甘蔗组织通常含有大量顽拗性物 质，如多糖、醌类和多酚等，会影响双向电泳分离蛋白的效果，进而干扰后期的质谱鉴定工 作。 TCA法是一种经典而有效适用于双向电泳的蛋白质样品制备方法，其最大的优越 性在于能够快速有效的抑制各种蛋白酶的活性。但该法主要应用在动物及某些模式植物 中；另外，该法的明显缺陷是经过TCA沉淀下来的蛋白质很难溶解，并且没有办法去除样品 中的盐离子。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法，解决背景 技术中提到的技术问题。 一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法的制备方法，所述方法包括如下步 骤： 步骤1：准备实验器具和鲜组织样本； 步骤2：把组织样本在液氮的环境下研磨； 步骤3：使用BPP提取液对研磨后的组织样本进行混合离心处理得到混合液； 步骤4：对混合液进行洗涤，提取蛋白。 进一步地，所述步骤1的具体过程为： 步骤1.1：液氮准备，从液氮罐中倒取液氮到保温杯，准备研钵及研棒，倒入覆盖表 面的无水酒精，灼烧后备用； 步骤1.2：准备新鲜组织样本或从低温冰箱中取出组织样品，暂存于冰盒，立即连 同盛有样品的容器一起称重，并记录重量。 进一步地，所述步骤2的具体过程为： 步骤2.1：研磨开始前，研钵及研棒提前用液氮预冷；准备一个离心管，标记样品 名，放入盛有液氮的保温杯预冷； 步骤2.2：取称量好的组织样本，放入预冷的研钵中，并快速搅动磨成干粉状，在研 磨过程中一边研磨一边补充液氮保持样品低温； 步骤2.3：研磨完成后，加入刚没过组织样本的液氮，将不锈钢药勺在液氮中预冷， 4 CN 111718394 A 说 明 书 2/4 页 并将溅在研钵内的粉末用药勺集中到研钵底部，将组织粉末收集到上述预冷的对应离心管 中，重新投入液氮中备用； 步骤2.4：将空的锡纸和离心管称重，精确到0.1g，并样品粉末加入到锡纸戒离心 管称重，计算组织样品质量。 进一步地，所述步骤3的具体过程为： 步骤3.1：根据组织样品质量，计算BPP提取液用量，BPP提取液的用量为每克的组 织样品使用7ml BPP提取缓冲液。BPP提取缓冲液包括100mmol/L EDTA ,50mmol/L硼砂， 50mmol/L维生素C，1％PVPP，1％Triton X-100，0.1％β-巯基乙醇，25％蔗糖，10mmol/L Tris碱，Ph7.8)。 步骤3.2：研磨后分组织粉末按照3ml BPP buffer/1g组织样本的计算方式加入 BPP buffer，倒入溶液中，上下颠倒混匀，放入冰箱4℃水化1h备用；BPP buffer就是BPP提 取缓冲液。 步骤3.3：临用前，加入二硫苏糖醇，浓度为5mM；第一次抽提，临用前加入苯甲基磺 酰氟，浓度为1mM，混匀后，加入组织粉末中，充分混匀，超声后漩涡震荡5min； 步骤3.4：加入等体积的Tris饱和酚，其中Tris饱和酚的pH>7.8，室温涡混10min； 步骤3.5：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min； 步骤3.6：准备新的离心管，离心好后加入秱酚，再加入等体积的BPP Buffer，BPP Buffer临用前，加入二硫苏糖醇，终浓度为5mM，充分混匀后，室温涡混10min； 步骤3.7：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min； 步骤3.8：准备新的离心管，离心好后转加入秱酚，加入5倍体积的预冷的饱和硫酸 铵甲醇溶液，-20℃沉淀过夜。 进一步地，所述步骤3.3中超声后漩涡震荡的次数为30次，每次后漩涡震荡的时间 为10s，间隙时间为10s。 进一步地，所述步骤3.8中硫酸铵甲醇溶液由6.605g过硫酸铵粉末和500ml甲醇混 合而成。 进一步地，所述步骤4的具体过程为： 步骤4.1：将混合液放在冰上分装，使用离心机进行离心沉淀，温度为4℃，离心转 速为12500rpm时间为15min； 步骤4.2：弃上清后，每管加入-20℃预冷的甲醇打散重悬沉淀，配平后，使用离心 机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为15min； 步骤4.3：重复一次步骤4.2，弃上清，晾干沉淀； 步骤4.4：沉淀物加入裂解液，控制蛋白液浓度在5-8ug/ul，超声后漩涡震荡的次 数为30次，每次后漩涡震荡的时间为10s，间隙时间为10s； 步骤4.5：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min，收集上清，即为变性全蛋白裂解液。 进一步地，所述步骤4.3中晾干沉淀为风干，风干程度以蛋白块开始出现1-3mm裂 缝为准。 5 CN 111718394 A 说 明 书 3/4 页 本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果： 本发明具有广谱性，使用超声后漩涡震荡时单次时间短，可以有效的避免蛋白结 构的断裂和引入新的结构，效地解决了双向电泳蛋白质样品制备中的盐离子问题，可广泛 应用于各种植物，应用前景广阔。
本发明公开了一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法，属于变性蛋白提取技术领域，所述步骤包括，准备实验器具和鲜组织样本，把组织样本在液氮的环境下研磨，使用BPP提取液对研磨后的组织样本进行混合离心处理得到混合液，对混合液进行洗涤，提取蛋白。本发明具有广 全部
背景技术：
蛋白质组学研究中，目前最有效的方法是通过双向电泳技术(2-DE)分离蛋白质， 然后对分离蛋白进行质谱鉴定。由于各种用于双向电泳的蛋白质提取方法，往往因为植物 种类和组织部位的不同而差别很大，因此，提取高质量的蛋白质，成为双向电泳以及后期质 谱鉴定工作中最具挑战性的工作之一。植物组织，特别是甘蔗组织通常含有大量顽拗性物 质，如多糖、醌类和多酚等，会影响双向电泳分离蛋白的效果，进而干扰后期的质谱鉴定工 作。 TCA法是一种经典而有效适用于双向电泳的蛋白质样品制备方法，其最大的优越 性在于能够快速有效的抑制各种蛋白酶的活性。但该法主要应用在动物及某些模式植物 中；另外，该法的明显缺陷是经过TCA沉淀下来的蛋白质很难溶解，并且没有办法去除样品 中的盐离子。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法，解决背景 技术中提到的技术问题。 一种基于BPP法的甘蔗组织变性蛋白提取方法的制备方法，所述方法包括如下步 骤： 步骤1：准备实验器具和鲜组织样本； 步骤2：把组织样本在液氮的环境下研磨； 步骤3：使用BPP提取液对研磨后的组织样本进行混合离心处理得到混合液； 步骤4：对混合液进行洗涤，提取蛋白。 进一步地，所述步骤1的具体过程为： 步骤1.1：液氮准备，从液氮罐中倒取液氮到保温杯，准备研钵及研棒，倒入覆盖表 面的无水酒精，灼烧后备用； 步骤1.2：准备新鲜组织样本或从低温冰箱中取出组织样品，暂存于冰盒，立即连 同盛有样品的容器一起称重，并记录重量。 进一步地，所述步骤2的具体过程为： 步骤2.1：研磨开始前，研钵及研棒提前用液氮预冷；准备一个离心管，标记样品 名，放入盛有液氮的保温杯预冷； 步骤2.2：取称量好的组织样本，放入预冷的研钵中，并快速搅动磨成干粉状，在研 磨过程中一边研磨一边补充液氮保持样品低温； 步骤2.3：研磨完成后，加入刚没过组织样本的液氮，将不锈钢药勺在液氮中预冷， 4 CN 111718394 A 说 明 书 2/4 页 并将溅在研钵内的粉末用药勺集中到研钵底部，将组织粉末收集到上述预冷的对应离心管 中，重新投入液氮中备用； 步骤2.4：将空的锡纸和离心管称重，精确到0.1g，并样品粉末加入到锡纸戒离心 管称重，计算组织样品质量。 进一步地，所述步骤3的具体过程为： 步骤3.1：根据组织样品质量，计算BPP提取液用量，BPP提取液的用量为每克的组 织样品使用7ml BPP提取缓冲液。BPP提取缓冲液包括100mmol/L EDTA ,50mmol/L硼砂， 50mmol/L维生素C，1％PVPP，1％Triton X-100，0.1％β-巯基乙醇，25％蔗糖，10mmol/L Tris碱，Ph7.8)。 步骤3.2：研磨后分组织粉末按照3ml BPP buffer/1g组织样本的计算方式加入 BPP buffer，倒入溶液中，上下颠倒混匀，放入冰箱4℃水化1h备用；BPP buffer就是BPP提 取缓冲液。 步骤3.3：临用前，加入二硫苏糖醇，浓度为5mM；第一次抽提，临用前加入苯甲基磺 酰氟，浓度为1mM，混匀后，加入组织粉末中，充分混匀，超声后漩涡震荡5min； 步骤3.4：加入等体积的Tris饱和酚，其中Tris饱和酚的pH>7.8，室温涡混10min； 步骤3.5：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min； 步骤3.6：准备新的离心管，离心好后加入秱酚，再加入等体积的BPP Buffer，BPP Buffer临用前，加入二硫苏糖醇，终浓度为5mM，充分混匀后，室温涡混10min； 步骤3.7：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min； 步骤3.8：准备新的离心管，离心好后转加入秱酚，加入5倍体积的预冷的饱和硫酸 铵甲醇溶液，-20℃沉淀过夜。 进一步地，所述步骤3.3中超声后漩涡震荡的次数为30次，每次后漩涡震荡的时间 为10s，间隙时间为10s。 进一步地，所述步骤3.8中硫酸铵甲醇溶液由6.605g过硫酸铵粉末和500ml甲醇混 合而成。 进一步地，所述步骤4的具体过程为： 步骤4.1：将混合液放在冰上分装，使用离心机进行离心沉淀，温度为4℃，离心转 速为12500rpm时间为15min； 步骤4.2：弃上清后，每管加入-20℃预冷的甲醇打散重悬沉淀，配平后，使用离心 机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为15min； 步骤4.3：重复一次步骤4.2，弃上清，晾干沉淀； 步骤4.4：沉淀物加入裂解液，控制蛋白液浓度在5-8ug/ul，超声后漩涡震荡的次 数为30次，每次后漩涡震荡的时间为10s，间隙时间为10s； 步骤4.5：使用离心机进行离心处理，温度为4℃，离心转速为12500rpm时间为 15min，收集上清，即为变性全蛋白裂解液。 进一步地，所述步骤4.3中晾干沉淀为风干，风干程度以蛋白块开始出现1-3mm裂 缝为准。 5 CN 111718394 A 说 明 书 3/4 页 本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果： 本发明具有广谱性，使用超声后漩涡震荡时单次时间短，可以有效的避免蛋白结 构的断裂和引入新的结构，效地解决了双向电泳蛋白质样品制备中的盐离子问题，可广泛 应用于各种植物，应用前景广阔。
