技术摘要：
本发明属于生物医药的技术领域，具体为一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用，具体为提供了与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用，特别作为乳腺癌分子分型标志物的应用价值以及在制备乳腺癌分子分型试剂盒的应用。本发明还提供了筛选用于治疗乳腺癌  全部
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。 据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，仅约1-2％的乳腺癌患者是男性。在妇 女仅次于子宫癌，它的发病常与遗传有关，以及40—60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较 高，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。 虽然乳腺癌的系统治疗已取得了显著进展，但许多患者仍然遭受着肿瘤的复发、 转移以及治疗耐药，严重影响患者生存和生活质量。因此，研究乳腺癌发生发展过程中涉及 的机制，找到乳腺癌的新治疗靶点是至关重要的。 2000年，Perou等人通过对65份乳腺癌组织的cDNA芯片数据分析，根据ER、PR、HER- 2和Ki67不同的分子特征首次提出了乳腺癌分子分型的概念，其中通过分类集群分析发现， 与中位丰度相比，在至少3个组织样本中有1753个基因的表达丰度发生了4倍以上的改变， 其中就包含IFI30。 目前IFI30作为乳腺癌分子分型标志物并指导预后和个性化治疗未见文献报道。 本发明发现了在乳腺癌组织中IFI30的表达与病人的预后相关，乳腺癌组织中IFI30的高表 达会增加乳腺癌患者的5年生存率。
技术实现要素：
本发明涉及IFI30的应用，具体为提供了与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因 IFI30的应用，特别作为乳腺癌分子分型标志物的应用价值以及在制备乳腺癌分子分型试 剂盒的应用。本发明还提供了筛选用于治疗乳腺癌潜在药物的方法，通过调节生物标志物 的表达水平来判断候选物是否是潜在的治疗乳腺癌的药物。 本发明的技术方案为： 一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用，具体为，通过改变IFI30表 达水平的试剂在评价乳腺癌进展、预后及治疗反应性产品中的应用。其中，IFI30的低表达 可以增加细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和减少细胞凋亡。 本发明的第一方面：所述一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用， 具体为，IFI30在制备乳腺癌分子分型标志物中的应用。 本发明的第二方面：所述一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用具 体为，IFI30在制备乳腺癌IFI30表达强度免疫组化检测试剂盒中的应用。所述的乳腺癌 IFI30表达强度免疫组化检测试剂盒，检测IFI30表达水平。 进一步的，所述的试剂盒，是通过免疫组织化学方法检测生物样品中IFI30的表达 情况。 4 CN 111575382 A 说　明　书 2/13 页 进一步的，所述的试剂盒，包括：特异性识别人IFI30的抗体、免疫组化实验试剂。 进一步的，所述的生物样品，为病人乳腺癌的石蜡包埋组织。 本发明的第三方面：与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用，具体为，所 述的乳腺癌分子分型试剂盒的检测方法，具体步骤如下： 步骤1.脱蜡至水 (1)4μm厚石蜡切片，每个肿瘤组织2张连续切片，60℃烤箱烤1h； (2)二甲苯10min  x  3次； (3)依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水，各5min； 步骤2.抗原修复 (1)3％H2O2甲醇液20min； (2)双蒸水洗5minx  3次； (3)抗原修复(高压修复)： 切片放入盛有EDTA碱性修复液(2mM  EDTA、2mM  Na2HPO4)的高压锅中，高压煮沸 2min，自然冷却至室温； 步骤3.一抗孵育 (1)PBS洗5min； (2)50μl  1％BSA覆盖组织，37℃封闭30min； (3)吸去封闭液，分别滴加IFI30一抗50μl，湿盒中4℃孵育过夜； 步骤4.二抗孵育 (1)吸走一抗，PBS洗5minx  4次； (2)滴加50μl带HRP标记的二抗，37℃孵育30-45min； 步骤5.显色、反蓝 (1)PBS洗5minx  4次； (2)DAB(1:50)显色3-10min，至出现砖红色沉淀，双蒸水终止显色； (3)苏木素复染10min，盐酸酒精分化后自来水冲洗反蓝20-30min； 步骤6.脱水封片 依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各 5min。滴加树脂封片； 步骤7.观察评价和评分 由2名病理科医生对染色后切片进行评价，显微镜下观察乳腺癌细胞IFI30的表达 水平。2名病理科医生在不明确患者任何临床信息的前提下以“背靠背”的方式进行，依据改 良的Harvey评分标准评价染色结果。评分结果分为两部分：IFI30染色强度IFI30染色阳性 细胞比例。染色强度分为0(细胞未着色)、1 (细胞胞浆呈现浅棕色)、2 (细胞胞浆呈现中等 程度着色)和3 (细胞胞浆呈现深棕色)分别记为0分、1分、2分和3分。统计乳腺癌细胞IFI30 染色阳性的比例，按照阳性细胞比例分为0分(无阳性细胞)、1分(＜1/100细胞特异性染 色)、2分(1/100-1/10细胞特异性染色)、3分(1/10-1/3细胞特异性染色)、4分(1/3-2/3细胞 特异性染色)和5分(＞2/3细胞特异性染色)。最终得到染色范围得分、染色强度得分和两者 总分。 图1所示为免疫组化染色后，乳腺癌组织IFI-30表达强度示意图，图中黑色椭圆形 5 CN 111575382 A 说　明　书 3/13 页 为细胞核，细胞核周围为细胞质，IFI-30染色为细胞质着色，在显微镜下观察为棕色，根据 棕色强度不同分为0、1 、2 、3 ，图中所示细胞质灰色越深，表明DAB着色越深，强度越强，从 左到右IFI-30强度依次为0、1 、2 、3 。 本发明的第四方面：所述一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用， 具体为，上述检测乳腺癌组织中IFI30表达水平的试剂盒在制备乳腺癌分子分型试剂盒中 的应用。 进一步的，该乳腺癌分子分型试剂盒，用于检测乳腺癌组织中IFI30表达水平。 进一步的，所述的乳腺癌分子分型试剂盒通过免疫组织化学方法检测生物样品中 IFI30的表达情况。 进一步的，所述的乳腺癌分子分型试剂盒，包括：特异性识别人IFI30的抗体、免疫 组化实验试剂。 进一步的，所述的生物样品，为病人乳腺癌的石蜡包埋组织。 本发明的第五方面：所述一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用， 具体为，IFI30在筛选用于治疗乳腺癌潜在物质中的应用。 进一步的，该IFI30在筛选用于治疗乳腺癌潜在物质中的应用，具体为方法为：用 候选物质处理表达或含有IFI30的体系和检测所述体系中IFI30基因/蛋白的表达；若所述 候选物质可提高IFI30的表达水平，则表明该候选物质是用于治疗乳腺癌的潜在物质；进一 步的，候选物质可提高IFI30的表达水平的比例为高于20％以上，优选为50％以上，最优为 80％以上。 进一步的，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系 或动物体系。 进一步的，所述候选物质包括但不限于：针对IFI30基因或其上游基因或其下游基 因设计的过表达载体、特异性抗体或激活小分子化合物；进一步的，本发明中的候选物质优 选的是IFI30的慢病毒过表达载体。 本发明的第六方面：所述一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用， 具体为，提供了IFI30在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。 进一步，所述药物组合物包括IFI30功能性表达的激活剂，所述激活剂选自：含特 异激活IFI30基因/蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体。所述的肿瘤为IFI30蛋白 质低表达。 优选的，所述的药物组合物包含能上调IFI30mRNA或蛋白水平或其它能特异结合 IFI30基因/蛋白质并促进其表达或活性的小分子物质、特异性抗体。 进一步，所述药物组合物还包括与所述激活剂配伍的药类以及药学上可接受的载 体和/或辅料。 药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生 理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。 本发明的第七方面：提供了一种用于治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物 包括： IFI30功能性表达的激活剂；和 药学上可接受的载体。 6 CN 111575382 A 说　明　书 4/13 页 药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生 理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。 本发明的有益效果在于， 本发明使用了乳腺癌细胞系来验证IFI30在体内和体外的生物行为。研究结果表 明，乳腺癌细胞中IFI30的低表达可以增加细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和减少细胞凋 亡。在裸鼠实验中发现，将IFI30高表达的细胞系异种移植到裸鼠皮下后，肿瘤的形成速度 以及肿瘤大小会明显降低。以上结果提示，IFI30可以作为独立的指导乳腺癌预后生物标志 物及新的分子分型标志物。 本发明通过上述的研究，提供了与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应 用，特别作为乳腺癌分子分型标志物的应用价值以及在制备乳腺癌分子分型试剂盒的应 用。本发明还提供了筛选用于治疗乳腺癌潜在药物的方法，通过调节生物标志物的表达水 平来判断候选物是否是潜在的治疗乳腺癌的药物。 总之，本发明的与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因IFI30的应用，为乳腺癌分子 分型的检测、乳腺癌的治疗、以及预后等都具有积极的作用。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而 言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 图1为乳腺癌组织的IFI-30蛋白免疫组化染色图。 图2为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后荧光显微镜下观察图。 图3为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后WesternBlot显影图。 图4为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后Real-Time  PCR检测的IFI-30基 因相对表达量柱状图。 图5为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后细胞的增长曲线图。 图6为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后EDU染色荧光显微镜观察图。 图7为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达病毒后裸鼠成瘤图。 图8为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后Transwell细胞侵袭实验显微镜 观察图。 图9为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达病毒后细胞对多西他赛ic50的柱状图。 图10为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达/沉默病毒后细胞对表柔比星、多西他赛 ic50的柱状图，其中a为表柔比星，b为多西他赛。 图11为乳腺癌细胞转染IFI-30过表达病毒后放疗敏感性改变示意图。 图12为乳腺癌患者根据IFI-30表达范围、强度、总评分分组后的生存分析图。 图13为重组IFI-30蛋白的Western  Blot显影图。 图14为重组IFI-30蛋白的Trypsin酶切的供试品的肽段序列覆盖率。 图15为重组IFI-30蛋白的Chymotrypsin酶切的供试品的肽段序列覆盖率。 图16为重组IFI-30蛋白的Glu-C酶切的供试品的肽段序列覆盖率。 图17为重组IFI-30蛋白的综合氨基酸序列覆盖率。 7 CN 111575382 A 说　明　书 5/13 页 图18为重组IFI-30蛋白孵育乳腺癌细胞后免疫荧光染色，荧光显微镜观察图。 图19为在乳腺癌细胞中加入重组IFI-30蛋白后对细胞增殖影响的柱状图。