技术摘要：
本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I‑DNA加合物的检测和相对定量方法，包括以下步骤：A、马兜铃酸I‑DNA加合物的制备和鉴定；B、将组织DNA进行酶解；C、采用步骤A制得的马兜铃酸I‑DNA加合物作为标准品，对步骤B获得的DNA酶解产物进行检测和相对定量。本发明可以用于  全部
背景技术：
化学致癌物是引起癌症的主要原因之一，其中主要的作用方式是化学致癌物的代 谢产物可以以共价键的形式结合在DNA上，形成DNA加合物，而DNA加合物会引起DNA断裂或 突变，从而导致癌症的发生，例如黄曲霉素和马兜铃酸等就是通过这种方式引起癌症。另 外，像这两种化学致癌物形成的DNA加合物可以长期存在与组织中。因此，对于DNA加合物的 检测，不仅可以有助于揭示病因学，而且还可以判定是否有某种化学致癌物的暴露。 检测DNA加合物的方法主要包括免疫分析法、32P后标记法和质谱法等。32P后标记 法具有非常高的灵敏度，可达1个加合物/1010个核苷酸，而且DNA用量最少，非常适用于有限 的人类样本检测，但是该方法需要使用放射性同位素，而且操作费时和低产率。免疫分析法 和质谱法的灵敏度为1个加合物/108个核苷酸，需要的DNA也比32P后标记法多。免疫分析法 受限于特异识别DNA加合物的抗体。基于质谱(MS)的方法越来越多的用于检测和定量各种 DNA加合物，而且MS也可以鉴定新加合物。MS通常与液相色谱(HPLC和UPLC)或气相色谱(GC) 系统联用，将感兴趣的加合物从未被修饰的核苷酸或其他干扰损伤中分离出来。MS法具有 最高的特异性而且可以获得结构信息，不足之处是需要加合物标准品。 据检索，现有技术中对于马兜铃酸I-DNA加合物的检测方法主要有：32P后标记法和 质谱法，另外还有报道通过荧光法来检测，如专利文献CN106198771A中公开了一种同时测 定组织中两种马兜铃酸-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析方法，其直接将组织中提取的DNA 消化后，采用HPLC-FLD测定AA-DNA加合物、采用HPLC-DAD测定脱氧腺苷。但是该方法不够准 确。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种检测和相对定量DNA中马兜铃酸I  DNA加合物(dA-AL- I)的方法。本发明利用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ  MS)，以合成的dA-AL- I作为标准品，对组织中的dA-AL-I进行检测和相对定量。该方法有助于揭示病因学，还可以 为判定是否有马兜铃酸I的暴露提供参考。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的检测和相对定量 方法，包括以下步骤： A、马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备和鉴定； B、将组织DNA进行酶解； C、采用步骤A制得的马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)作为标准品，对步骤B获得的 3 CN 111610259 A 说　明　书 2/4 页 DNA酶解产物进行检测和相对定量。 优选地，步骤A中，所述兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备步骤如下：将脱氧腺 苷和马兜铃酸I溶于磷酸钾溶液中，加入锌粉，避光反应，即得兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL- I)。 优选地，所述脱氧腺苷与磷酸钾溶液的固液比为2:1(g/ml)；所述马兜铃酸I与磷 酸钾溶液的固液比为1:1(g/ml)；所述磷酸钾溶液的浓度为50mM，pH值为5.8。 优选地，所述避光反应的温度为37℃、反应时间为16h。 优选地，步骤A中，所述鉴定采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC- QTOF-MS)进行。 优选地，步骤B中，所述酶解的方法具体包括以下步骤： B1、提取组织DNA； B2、采用脱氧核糖核酸酶I、核酸酶P1、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶I对组织DNA进行 酶解。 优选地，步骤B2中，加入所述脱氧核糖核酸酶I进行酶解的条件为：37℃温育1.5h； 加入所述核酸酶P1进行酶解的条件为：37℃温育3h；加入所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶I进 行酶解的条件为：37℃温育18h。 优选地，步骤C中，采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ  MS)对所述 DNA酶解产物进行检测和相对定量。 优选地，步骤C中，所述DNA酶解产物进行检测和相对定量前，先进行冷冻干燥，然 后溶于1:1的H2O/DMSO的混合溶液中。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1、本发明是针对马兜铃酸I  DNA加合物(dA-AL-I)进行检测和相对定量，采用超高 效液相色谱/三重四极杆质谱可以高效简易准确地实现马兜铃酸I  DNA加合物检测和相对 定量。 2、本发明不仅可以作为基础研究的手段，有助于揭示病因学，还可以为判定是否 有马兜铃酸I的暴露提供参考。 附图说明 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显： 图1为本发明实施例1通过MS(上方)和MS/MS(下方)扫描获得的合成的dA-AL-I的 离子谱；其中，图1a为dA-AL-I的离子谱；图1b为dA-AL-I的裂解途径； 图2为本发明实施例2的DNA酶解效果鉴定； 图3为本发明实施例3的DNA中dA-AL-I的鉴定； 图4为本发明实施例3检测的组织DNA中dA-AL-I的相对定量。