技术摘要：
本发明公开了一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型的方法，包括如下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*3基因型；其中，用于PCR扩 全部
背景技术：
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中重要的成员。位于10号染色体上，由490个氨基 酸组成的蛋白，生物体许多组织中都有表达，主要在肝组织中表达，目前在临床应用中，至 少10％的药物作用于它。CYP2C19具有很多的SNP位点，目前，在已发现的CYP2C19的25个突 变等位基因中至少10个突变造成酶活性的改变，其中慢代谢型以CYP2C19*2,CYP2C19*3为 主，快代谢型以CYP2C19*17为主。 亚洲人和太平洋岛居民对于CYP2C19有更高概率的无功能突变，这些突变可能会 影响相关药物的治疗，例如治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病用的抗血小板药物氯吡咯雷， 本身不具备活性，需要生物体吸收转化后发挥抗血小板作用，不同个体间CYP2C19等相关基 因的多态性引起功能蛋白水平的差异，从而影响氯吡咯雷的活性代谢水平。因此，准确测定 CYP2C19的基因型对于药物的用量和疾病的治疗有着重要的意义。 目前，对CYP2C19基因分型的检测方法有很多种，常规的方法包括：(1)直接测序 法，通过抽取人外周静脉血，提取基因组DNA，扩增后进行DNA直接测序，从而判断基因型；该 方法能够直接显示已知突变位点的位置和类型。但是，该方法的检测周期长，通量低，成本 高。(2)RFLP法(限制性片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism)， 该技术原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。但是，该方法的 SNP位点必须含有酶切位点，受限制性高。(3)PCR-SSCP法，是1989年日本Orita等创建的筛 查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理 是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不 同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基 的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后 的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变 位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检 测是测序之前突变筛查的常用手段。但是，该方法的技术要求高，检出率低。(4)HRM法(High Resolution Melt)，即“高分辨率熔解曲线”，是近几年来在国外兴起的最新SNP及突变研究 工具，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分 型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列 特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。但 是该方法的仪器设备比较复杂，使用不方便。(5)SNaPshot基因分型技术是由美国ABI公司 开发的一种基于荧光标记单碱基延伸链终止反应原理的分型技术，主要针对中小通量的 SNP分型项目。但是该方法的成本高，操作步骤繁琐。 QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)，即实时荧光定量核酸 3 CN 111607644 A 说 明 书 2/4 页 扩增检测系统。该技术结合TaqMan探针可以快速检测DNA中某个核酸位点的突变。TaqMan荧 光探针是一种寡核苷酸探针，5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭集团，能与模板特异性结 合，完整的探针荧光信号被淬灭基团吸收，随着PCR扩增进行，Taq酶的外切酶活性将探针酶 切水解，释放荧光基团，从而检测到荧光信号。
技术实现要素：
本发明针对CYP2C19的*2，*3的突变位点设计特异性TaqMan探针及引物，配合实时 荧光定量PCR技术，能同时测定多个样本，快速精确的进行SNP基因型测定。因此，本发明的 第一个目的在于提供一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型的方法。本发明 的第二个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。本发明的第 三个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒。本发明的第四个目的在于提 供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19 基因分型中的应用。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 作为本发明的第一个方面，一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型 的方法，包括如下步骤： 第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物； 第二步，检测扩增产物的荧光信号； 第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*2或CYP2C19*3基因型； 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对和 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针， 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示； 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8 所示。 根据本发明，所述PCR扩增的条件如下： 反应体系为20μL：2×HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix，10μL；引物各10μ M，0.4μL；探针10μM，0.2μL；人基因组10ng；余量为无菌超纯水； PCR反应条件：预变性，95℃，1min,1个循环；变性，95℃，10s；退火、延伸60℃，30s； 40个循环。 作为本发明的第二个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针， 包括用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针， 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示； 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8 所示。 作为本发明的第三个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒 包括上述所述的用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。 作为本发明的第四个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾 4 CN 111607644 A 说 明 书 3/4 页 病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型中的应用。 本发明的有益效果是： 1、本发明运用TaqMan qPCR法能一次进行中等密度的检测，时间短，操作简单。 2、本发明设计的探针及引物，具有高度特异性，检测结果精确度高。 3、相比于其他方法，其成本较低。 附图说明 图1为96个样本CYP2C19*2位点SNP分型结果。 图2为48个样本CYP2C19*3位点SNP分型结果。
本发明公开了一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型的方法，包括如下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*3基因型；其中，用于PCR扩 全部
背景技术：
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中重要的成员。位于10号染色体上，由490个氨基 酸组成的蛋白，生物体许多组织中都有表达，主要在肝组织中表达，目前在临床应用中，至 少10％的药物作用于它。CYP2C19具有很多的SNP位点，目前，在已发现的CYP2C19的25个突 变等位基因中至少10个突变造成酶活性的改变，其中慢代谢型以CYP2C19*2,CYP2C19*3为 主，快代谢型以CYP2C19*17为主。 亚洲人和太平洋岛居民对于CYP2C19有更高概率的无功能突变，这些突变可能会 影响相关药物的治疗，例如治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病用的抗血小板药物氯吡咯雷， 本身不具备活性，需要生物体吸收转化后发挥抗血小板作用，不同个体间CYP2C19等相关基 因的多态性引起功能蛋白水平的差异，从而影响氯吡咯雷的活性代谢水平。因此，准确测定 CYP2C19的基因型对于药物的用量和疾病的治疗有着重要的意义。 目前，对CYP2C19基因分型的检测方法有很多种，常规的方法包括：(1)直接测序 法，通过抽取人外周静脉血，提取基因组DNA，扩增后进行DNA直接测序，从而判断基因型；该 方法能够直接显示已知突变位点的位置和类型。但是，该方法的检测周期长，通量低，成本 高。(2)RFLP法(限制性片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism)， 该技术原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。但是，该方法的 SNP位点必须含有酶切位点，受限制性高。(3)PCR-SSCP法，是1989年日本Orita等创建的筛 查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理 是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不 同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基 的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后 的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变 位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检 测是测序之前突变筛查的常用手段。但是，该方法的技术要求高，检出率低。(4)HRM法(High Resolution Melt)，即“高分辨率熔解曲线”，是近几年来在国外兴起的最新SNP及突变研究 工具，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分 型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列 特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。但 是该方法的仪器设备比较复杂，使用不方便。(5)SNaPshot基因分型技术是由美国ABI公司 开发的一种基于荧光标记单碱基延伸链终止反应原理的分型技术，主要针对中小通量的 SNP分型项目。但是该方法的成本高，操作步骤繁琐。 QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)，即实时荧光定量核酸 3 CN 111607644 A 说 明 书 2/4 页 扩增检测系统。该技术结合TaqMan探针可以快速检测DNA中某个核酸位点的突变。TaqMan荧 光探针是一种寡核苷酸探针，5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭集团，能与模板特异性结 合，完整的探针荧光信号被淬灭基团吸收，随着PCR扩增进行，Taq酶的外切酶活性将探针酶 切水解，释放荧光基团，从而检测到荧光信号。
技术实现要素：
本发明针对CYP2C19的*2，*3的突变位点设计特异性TaqMan探针及引物，配合实时 荧光定量PCR技术，能同时测定多个样本，快速精确的进行SNP基因型测定。因此，本发明的 第一个目的在于提供一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型的方法。本发明 的第二个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。本发明的第 三个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒。本发明的第四个目的在于提 供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19 基因分型中的应用。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 作为本发明的第一个方面，一种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型 的方法，包括如下步骤： 第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物； 第二步，检测扩增产物的荧光信号； 第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*2或CYP2C19*3基因型； 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对和 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针， 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示； 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8 所示。 根据本发明，所述PCR扩增的条件如下： 反应体系为20μL：2×HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix，10μL；引物各10μ M，0.4μL；探针10μM，0.2μL；人基因组10ng；余量为无菌超纯水； PCR反应条件：预变性，95℃，1min,1个循环；变性，95℃，10s；退火、延伸60℃，30s； 40个循环。 作为本发明的第二个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针， 包括用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针， 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示； 用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8 所示。 作为本发明的第三个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒 包括上述所述的用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。 作为本发明的第四个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾 4 CN 111607644 A 说 明 书 3/4 页 病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型中的应用。 本发明的有益效果是： 1、本发明运用TaqMan qPCR法能一次进行中等密度的检测，时间短，操作简单。 2、本发明设计的探针及引物，具有高度特异性，检测结果精确度高。 3、相比于其他方法，其成本较低。 附图说明 图1为96个样本CYP2C19*2位点SNP分型结果。 图2为48个样本CYP2C19*3位点SNP分型结果。
