技术摘要：
本发明涉及一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明采用在伯克霍尔德氏菌属MEL01摇瓶培养2d后静置培养3d，或摇瓶培养2d后继续摇瓶培养3天，每天加入禾谷镰刀菌菌丝，连续加入3次，利用该发酵方法得到的上清液对 全部
背景技术：
禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)是一种可以引起小麦、大麦、水稻和玉米等多 种禾本科作物发生赤霉病的重要病原菌之一。会使作物的穗部患病，籽粒皱缩，从而降低作 物产量。更重要地是，禾谷镰刀菌在侵染作物的过程中，会产生有毒的代谢产物，脱氧雪腐 镰刀烯醇毒素(deoxynivalanol，DON)，其性质稳定，耐热、耐压、耐弱酸、耐储藏，一般的食 品加工过程不能破坏其结构，加碱或高压处理才可破坏部分毒素。当人摄食被DON污染的谷 物制成的食品后可能会引起呕吐、腹泻、头疼、头晕等以消化系统和神经系统为主要症状的 中毒症。 2015年国际食品法典委员会(CAC)首次颁布了DON限量标准，规定未加工的谷物中 DON限量为2000μg/kg，谷物制品中限量为1000μg/kg，婴幼儿谷物食品中限量为200μg/kg。 目前，防治赤霉病的手段，大多使用的是化学药剂防治，但是化学药剂会对人类的身体健康 和环境造成严重的危害，还会引起禾谷镰刀菌的抗性发展。利用微生物实现生物防治具有 高效低毒、安全环保等多种优势，现已逐步成为植物病害防治新的有效途径之一。 迄今为止，已有一些伯克霍尔德氏菌属对植物病害防治方面的研究。2010 年，任 嘉红等人发现吡咯伯克霍尔德氏菌属JK-SH007对杨树溃疡病3种主要病原菌拟茎点霉 (Phomopsismacrospore)、金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、七叶树壳梭孢菌 (Fusicoccumaesculi)抑制作用较强，能有效防治杨树溃疡病。 2016年，毕可可等人发现一 株伯克霍尔德氏菌属对油菜菌核病病原菌 (Sclerotiniasclerotiorum)、黑松叶斑病病原 菌(Pestalotiopsissp.)、香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)、白蝴蝶 炭 疽 病 病 原 菌 ( C o l l e t o t r i c h u m s p . ) 和 美 人 蕉 瘟 病 病 原 菌 (Pyriculariacannaecolahashioka)等植物病原真菌均有明显的抑制作用。 但鲜有报道伯克霍尔德氏菌属可以抑制禾谷镰刀菌。张志斌等报道一株东乡野生 稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32以及建仁等报道一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔 德菌NSM-05可抑制小麦赤霉病菌。但是，关于提高伯克霍尔德氏菌属抑制禾谷镰刀菌活性， 以及提高伯克霍尔德氏菌属抑菌活性的发酵方法没有相关研究报道。且本研究发现，在一 般的摇瓶发酵条件下，伯克霍尔德氏菌属发酵液不能抑制禾谷镰刀菌。 因此，本发明提供一株来源于湖北钟祥磷矿镇稻麦轮作区田间土壤中的天然生防 菌伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01，在防治麦类赤霉病中应用及培养方法。该 申请中简单、高效的发酵培养方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属的抑菌活性。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍 3 CN 111607537 A 说 明 书 2/6 页 尔德氏菌属的制备方法及其应用，该发酵方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属 (Burkholderiasp.)MEL01对禾谷镰刀菌的抑制活性，并可抑制其合成DON毒素。 经过发明人不懈努力和大量试验，最终获得了一种高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍 尔德氏菌属MEL01的简单制备方法，该方法包括如下步骤： (1)从平板上挑取MEL01单菌落，接入无菌的LB液体培养基中，在28℃、 180r/min 的条件下，培养24h，进行活化； (2)将步骤1)的活化菌液按5％的接种量，转接到500mL无菌的PDB发酵培养基中， 在28℃、180r/min的条件下，培养2d； (3)将步骤2)摇瓶发酵的发酵液，在28℃的条件下静置培养3d，得到 MEL01发酵 液； 或： 摇瓶培养2d后继续摇瓶培养3天，每天加入禾谷镰刀菌菌丝，连续加入3 次，得到 伯克霍尔德氏菌属发酵液。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的制备方法中，所述的 伯克霍尔德氏菌属为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01，已保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo.M2015778,保藏日期：2015年 12月25日。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的应用，所述发酵液可 以抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子萌发和抑制DON的合成。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的应用，所述发酵液均 匀的喷洒在扬花初期的小麦麦穗上，可有效防治小麦赤霉病。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： (1)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01在平板培养时，对 禾谷镰刀菌的抑制率达到67.74±1.34％；使用本发明提供的发酵培养方法后，有效提高了 MEL01发酵液对禾谷镰刀菌的抑制率，达到了97.8％，且可抑制禾谷镰刀菌合成DON。5.0× 105CFU/mL菌浓度的MEL01菌悬液即可完全抑制禾谷镰刀菌孢子萌发形成菌丝。 (2)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01发酵液，在大田小 麦赤霉病的防治实验中，喷施MEL01菌悬液后相比不打药的组，小麦的病情指数降低了 48.98％，喷洒伯克霍尔德氏菌属发酵液组小麦DON含量未检出。 (3)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属，作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发 新的生物农药或者新的生物防治菌剂方面，该菌都具有良好的应用前景。 附图说明： 图1是MEL01在PDA平板上对禾谷镰刀菌等真菌的抑制活性，其中A为禾谷镰刀菌、B 为花生叶霉病菌、C为绿霉菌、D为草莓灰霉病菌、E为核盘菌、 F为稻瘟病菌、G为灰霉菌、H为 稻曲病菌、I为纹枯病菌、J为拟盘多毛孢菌。 图2是不同MEL01浓度对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响。 图3是不同培养方法得到的MEL01发酵液薄层层析分析(展层剂：氯仿：甲醇＝9: 1v/v)。 图4是不同培养方法得到的MEL01发酵液对禾谷镰刀菌抑制效果，a为MEL01摇瓶5d 4 CN 111607537 A 说 明 书 3/6 页 的发酵上清液，b为MEL01摇瓶2天后静置3天的发酵上清液， c为MEL01摇瓶2天后加禾谷镰 刀菌菌丝摇3天的发酵上清液。 图5是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌菌丝的影响。 图6是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响。 图7是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌感染小麦麦穗的影响。
本发明涉及一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明采用在伯克霍尔德氏菌属MEL01摇瓶培养2d后静置培养3d，或摇瓶培养2d后继续摇瓶培养3天，每天加入禾谷镰刀菌菌丝，连续加入3次，利用该发酵方法得到的上清液对 全部
背景技术：
禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)是一种可以引起小麦、大麦、水稻和玉米等多 种禾本科作物发生赤霉病的重要病原菌之一。会使作物的穗部患病，籽粒皱缩，从而降低作 物产量。更重要地是，禾谷镰刀菌在侵染作物的过程中，会产生有毒的代谢产物，脱氧雪腐 镰刀烯醇毒素(deoxynivalanol，DON)，其性质稳定，耐热、耐压、耐弱酸、耐储藏，一般的食 品加工过程不能破坏其结构，加碱或高压处理才可破坏部分毒素。当人摄食被DON污染的谷 物制成的食品后可能会引起呕吐、腹泻、头疼、头晕等以消化系统和神经系统为主要症状的 中毒症。 2015年国际食品法典委员会(CAC)首次颁布了DON限量标准，规定未加工的谷物中 DON限量为2000μg/kg，谷物制品中限量为1000μg/kg，婴幼儿谷物食品中限量为200μg/kg。 目前，防治赤霉病的手段，大多使用的是化学药剂防治，但是化学药剂会对人类的身体健康 和环境造成严重的危害，还会引起禾谷镰刀菌的抗性发展。利用微生物实现生物防治具有 高效低毒、安全环保等多种优势，现已逐步成为植物病害防治新的有效途径之一。 迄今为止，已有一些伯克霍尔德氏菌属对植物病害防治方面的研究。2010 年，任 嘉红等人发现吡咯伯克霍尔德氏菌属JK-SH007对杨树溃疡病3种主要病原菌拟茎点霉 (Phomopsismacrospore)、金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、七叶树壳梭孢菌 (Fusicoccumaesculi)抑制作用较强，能有效防治杨树溃疡病。 2016年，毕可可等人发现一 株伯克霍尔德氏菌属对油菜菌核病病原菌 (Sclerotiniasclerotiorum)、黑松叶斑病病原 菌(Pestalotiopsissp.)、香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)、白蝴蝶 炭 疽 病 病 原 菌 ( C o l l e t o t r i c h u m s p . ) 和 美 人 蕉 瘟 病 病 原 菌 (Pyriculariacannaecolahashioka)等植物病原真菌均有明显的抑制作用。 但鲜有报道伯克霍尔德氏菌属可以抑制禾谷镰刀菌。张志斌等报道一株东乡野生 稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32以及建仁等报道一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔 德菌NSM-05可抑制小麦赤霉病菌。但是，关于提高伯克霍尔德氏菌属抑制禾谷镰刀菌活性， 以及提高伯克霍尔德氏菌属抑菌活性的发酵方法没有相关研究报道。且本研究发现，在一 般的摇瓶发酵条件下，伯克霍尔德氏菌属发酵液不能抑制禾谷镰刀菌。 因此，本发明提供一株来源于湖北钟祥磷矿镇稻麦轮作区田间土壤中的天然生防 菌伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01，在防治麦类赤霉病中应用及培养方法。该 申请中简单、高效的发酵培养方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属的抑菌活性。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍 3 CN 111607537 A 说 明 书 2/6 页 尔德氏菌属的制备方法及其应用，该发酵方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属 (Burkholderiasp.)MEL01对禾谷镰刀菌的抑制活性，并可抑制其合成DON毒素。 经过发明人不懈努力和大量试验，最终获得了一种高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍 尔德氏菌属MEL01的简单制备方法，该方法包括如下步骤： (1)从平板上挑取MEL01单菌落，接入无菌的LB液体培养基中，在28℃、 180r/min 的条件下，培养24h，进行活化； (2)将步骤1)的活化菌液按5％的接种量，转接到500mL无菌的PDB发酵培养基中， 在28℃、180r/min的条件下，培养2d； (3)将步骤2)摇瓶发酵的发酵液，在28℃的条件下静置培养3d，得到 MEL01发酵 液； 或： 摇瓶培养2d后继续摇瓶培养3天，每天加入禾谷镰刀菌菌丝，连续加入3 次，得到 伯克霍尔德氏菌属发酵液。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的制备方法中，所述的 伯克霍尔德氏菌属为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01，已保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo.M2015778,保藏日期：2015年 12月25日。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的应用，所述发酵液可 以抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子萌发和抑制DON的合成。 如上所述的一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的应用，所述发酵液均 匀的喷洒在扬花初期的小麦麦穗上，可有效防治小麦赤霉病。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： (1)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01在平板培养时，对 禾谷镰刀菌的抑制率达到67.74±1.34％；使用本发明提供的发酵培养方法后，有效提高了 MEL01发酵液对禾谷镰刀菌的抑制率，达到了97.8％，且可抑制禾谷镰刀菌合成DON。5.0× 105CFU/mL菌浓度的MEL01菌悬液即可完全抑制禾谷镰刀菌孢子萌发形成菌丝。 (2)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01发酵液，在大田小 麦赤霉病的防治实验中，喷施MEL01菌悬液后相比不打药的组，小麦的病情指数降低了 48.98％，喷洒伯克霍尔德氏菌属发酵液组小麦DON含量未检出。 (3)本发明提供的伯克霍尔德氏菌属，作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发 新的生物农药或者新的生物防治菌剂方面，该菌都具有良好的应用前景。 附图说明： 图1是MEL01在PDA平板上对禾谷镰刀菌等真菌的抑制活性，其中A为禾谷镰刀菌、B 为花生叶霉病菌、C为绿霉菌、D为草莓灰霉病菌、E为核盘菌、 F为稻瘟病菌、G为灰霉菌、H为 稻曲病菌、I为纹枯病菌、J为拟盘多毛孢菌。 图2是不同MEL01浓度对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响。 图3是不同培养方法得到的MEL01发酵液薄层层析分析(展层剂：氯仿：甲醇＝9: 1v/v)。 图4是不同培养方法得到的MEL01发酵液对禾谷镰刀菌抑制效果，a为MEL01摇瓶5d 4 CN 111607537 A 说 明 书 3/6 页 的发酵上清液，b为MEL01摇瓶2天后静置3天的发酵上清液， c为MEL01摇瓶2天后加禾谷镰 刀菌菌丝摇3天的发酵上清液。 图5是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌菌丝的影响。 图6是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响。 图7是MEL01发酵液(摇瓶2d后静置培养3d)对禾谷镰刀菌感染小麦麦穗的影响。
