技术摘要：
本发明公开了一种用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步骤1)、以草莓花雌蕊作为样品；步骤2)、蛋白提取；步骤3)、蛋白酶解；最终得冻干肽段。本发明还同时提供了利用上述任一方法所得的冻干肽段进行的质谱鉴定。本发明通过加入氯仿抽提水层提高蛋白提取率；氯  全部
背景技术：
杂交授粉是草莓育种的常用手段，而雌蕊可授性强弱是杂交成功的重要影响因 素。发育成熟的草莓雌蕊柱头表面覆有一层亲水蛋白膜，经研究报道可能与花粉识别和萌 发相关，因此可采用蛋白质组学方法研究雌蕊可授性。红颊草莓是日本育成的优质大果型 品种(杭州市农业科学研究院2006年引进)，是目前草莓杂交育种最常用的母本之一，因此 作为本实验主要研究对象。 草莓等浆果类植物细胞富含多糖、多酚、糖苷类等多种次生代谢物，会干扰蛋白酶 解过程，在提取中需要去除。常用的植物蛋白提取方法有丙酮三氯乙酸沉淀法和酚提法，酚 提法除杂效率更高，因此是草莓蛋白提取的主要方法。在传统酚提法中，组织细胞中的蛋白 首先溶入提取液水层，再经酚抽提变性溶入酚层，但由于酚能部分(约10％～15％)溶于水 相，水层中仍有少量酚和蛋白残留。本发明拟对传统的植物蛋白酚提法进行改进，加入氯仿 提取步骤，对水层中残留的蛋白进行进一步抽提，为后续的蛋白组学研究提供基础。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于质谱鉴定的草莓(特别是红颊草莓) 雌蕊蛋白提取方法。 为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方 法，包括：步骤1)、以草莓花雌蕊作为样品；步骤2)、蛋白提取；步骤3)、蛋白酶解；步骤2)依 次包括以下步骤： 2.1)、在0.2g样品中加入800±50μl预冷(3～5℃)的提取液Ⅰ混匀，再加入800±50 μl预冷(3～5℃)的提取液Ⅱ进行首次抽提，得到溶液层以及位于底部的细胞沉淀；所述溶 液层分为3层，从上至下依次为酚层、中间层和水层； 所述提取液Ⅰ：含0.7M蔗糖、0.1M氯化钾、0.5M  Tris(三羟甲基氨基甲烷)、2％巯基 乙醇和50mM  EDTA(乙二胺四乙酸)的水溶液，调pH至8.0； 提取液Ⅰ的制备方法为：在1L水中，加入0.7mol蔗糖、0.1mol氯化钾、0.5mol  Tris、 20ml巯基乙醇、50mmol  EDTA，再用盐酸调至PH8.0。 所述提取液Ⅱ：苯酚在Tris-HCl缓冲液(pH8.0,1M)中充分饱和的溶液； 2.2)、在步骤2.1)首次抽提所得的酚层中加入600±50μl提取液Ⅰ进行二次抽提， 得二次抽提酚层； 2.3)、在步骤2.1)首次抽提所得的中间层和水层中加入800±50μl氯仿进行抽提； 去除抽提所产生的水层，将抽提所产生的中间层和位于最下层的氯仿层与上述步骤2.2)所 得的二次抽提酚层进行合并； 4 CN 111592586 A 说　明　书 2/6 页 在所得的合并液中，加入6±1ml预冷(-18～-22℃)的0.1M醋酸铵甲醇，于-18～- 22℃静置(沉淀)12～16小时，离心后弃上清；所得的沉淀经预冷(-18～-22℃)的甲醇清洗 (至洗涤液中无色素残存)，冻干(于-70℃～-20℃冻干至恒重)，得蛋白粉； 2.4)、在步骤2.3)所得的蛋白粉中加入400±50μL裂解液，涡旋后超声，使蛋白粉 溶解(完全溶解)，所得的溶解液离心，取上清为蛋白溶液； 所述裂解液为：8M尿素，0.1M  Tris-HCl，1mM  PMSF(苯甲基磺酰氟)，调pH至8.0。 裂解液的制备方法为：在1L  Tris-HCl(pH  8.0，0.1M)缓冲液中，加入8mol尿素、 1mmol苯甲基磺酰氟。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的改进，所述步骤3)为： 将步骤2)所得的蛋白溶液还原烷基化，超滤除杂后于30～37℃胰酶酶解，所得肽 段溶液除盐后冻干，得冻干肽段。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的进一步改进，所述步骤 3)为： 取含200μg蛋白的蛋白溶液加入50mM  NH4HCO3(PH8.0)定容至100μL，再加入11μL、 100mM的DTT(二硫苏糖醇)溶液，混匀后于37±1℃反应1±0.2h；加入12μL  500mM的IAM(碘 乙酰胺)溶液，避光室温反应25～35min； 将所得反应液利用Amicon-Ultra-15超滤管除杂后加入50mM  NH4HCO3(PH8.0)至体 积为200μl，加入4μg  Trypsin(胰蛋白酶)，于37℃酶解12h～16h；酶解完成后，离心；再向超 滤管中加入50mM  NH4HCO3(PH8.0)后，离心；得肽段溶液。 进一步而言，肽段溶液中加入5％TFA(三氟乙酸)至TFA终浓度为0.1～1％(体 积％)，用PierceTMC18Tips除盐后冻干；得冻干肽段。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的进一步改进，所述步骤 2.1)、步骤2.2)、步骤2.3)的抽提均为：冰上颠倒混匀30±5min，于3～5℃离心。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的进一步改进，所述步骤 2.4)的超声为：于冰水浴中，以1000000焦耳能量、超声3s间歇5s的模式超声2min。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的进一步改进，所述步骤 1)为：取开花一天期的草莓花，将雌蕊(去花柄、花瓣、雄蕊后)液氮研磨成粉，作用样品。 作为本发明的适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法的进一步改进，所述草莓 为红颊草莓。 本发明还同时提供了利用上述任一方法所得的冻干肽段进行的质谱鉴定： 冻干肽段(肽段干粉)用0.1％甲酸水复溶后，经AcclaimTMPepMapTM100C18液相色 谱柱2h梯度在线分离后，进入Q  Exactive质谱仪进行DIA模式扫描分析；得到的原始文件导 入分析软件Spe c t r o n a u t  P u l s a r，与已有的草莓柱头蛋白鉴定库(专利号： 201810955714.6)匹配后得到蛋白鉴定结果。 在本发明，针对样品的的草莓雌蕊蛋白提取方法，设3次技术重复。本发明的离心 均在3～5℃下进行。 本发明在传统酚提法中加入了氯仿提取步骤以进一步抽提蛋白，样品经酚氯仿抽 提后冻干至恒重成蛋白粉。 在传统酚提法中，组织细胞中的蛋白首先溶入提取液水层，再经酚抽提变性溶入 5 CN 111592586 A 说　明　书 3/6 页 酚层，但由于酚能部分溶于水相，水层中仍有少量酚和蛋白残留。本发明通过加入氯仿抽提 水层提高蛋白提取率。氯仿也为蛋白变性剂，虽然其变性能力弱于酚，但其能溶解酚而不溶 于水，因此通过氯仿能将水层中残留的酚和蛋白萃取至氯仿层。采用本发明的方法，在2小 时梯度内3次技术重复共鉴定到红颊草莓雌蕊蛋白5697个。 附图说明 下面结合附图对本发明的