技术摘要：
本发明提供一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用，包括以下步骤：1)获得离体肿瘤组织并分离提取出原代肿瘤细胞,2)将所述步骤1)得到的原代肿瘤细胞收集后进行放疗处理,3)将步骤2)得到的放疗后的细胞进行破碎、梯度离心，收集携带放疗诱导产生的新抗原的肿瘤细胞细胞  全部
背景技术：
： 在免疫治疗领域，以疫苗为基础的治疗方法是一种效果显著的治疗手段，因为疫 苗疗法可以诱导和扩增针对抗原的免疫细胞，细菌类和病毒类疫苗已经拯救了数千万人类 的性命。然而，肿瘤疫苗的研发和治疗效果并没有达到理想中的预期，原因是因为不同个体 内的肿瘤细胞具有不同的抗原蛋白表达谱，而不同个体的免疫细胞也具有不同的免疫细胞 应答谱，因此在疫苗的设计过程中抗原的选择方案难以统一，并且肿瘤细胞具有免疫逃逸 能力，一旦个体的肿瘤细胞下调或沉默疫苗相关抗原，则会导致已经设计好的肿瘤疫苗很 难再次发挥作用，因此，如何设计理想的肿瘤疫苗显得尤为重要。 专利号为ZL200910204848.5的专利通过裂解耐受性肿瘤细胞得到肿瘤细胞抗原 组合物，将树突状细胞与耐受性肿瘤细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗癌树突状 细胞，由于肿瘤细胞经过了射线照射和/或化疗药物的筛选，由此得到的肿瘤细胞产生了与 肿瘤细胞不同的变化(比如特异表达了许多不同于肿瘤细胞的蛋白)，更接近接受过放疗 和/或化疗的癌症内的肿瘤细胞，因此，由该耐受性肿瘤细胞得到的抗原组合物制备的药 物，能够在体内和体外杀死引起癌症复发的肿瘤细胞。但是这种方式只能用于已发癌症的 治疗中，可以防止癌症复发，无法用于癌症的预防免疫治疗，且耐受性肿瘤细胞抗原组合物 的提取和筛选操作比较复杂，在应用上存在较多局限性。 肿瘤疫苗在设计过程中主要分为四个要素，分别是抗原、制剂、佐剂和递送载体， 抗原选择是最关键的一环。在放疗过程中，经过X射线照射后的肿瘤细胞会发生DNA断裂，一 部分肿瘤细胞会发生单链断裂或间隔一定距离的双链DNA断裂，这些断裂的DNA很容易以对 侧的互补链为模板使损伤得到修复，在这期间，如果产生错误和失败的修复就会造成DNA突 变从而导致新抗原的形成，还有一部分肿瘤细胞的DNA断裂会发生在对侧互补碱基或仅仅 间隔几个碱基对的位置上，这种双链的断裂不仅会导致DNA突变，还会导致细胞以凋亡，坏 死或自噬等方式死亡，在濒临死亡的细胞中，由钙网蛋白和二硫化物异构酶组成的内质网 蛋白复合物会向细胞膜表面转移，这些内质网蛋白复合物会募集巨噬细胞和树突细胞向其 周边聚集并对其吞噬，与此同时，放疗后的肿瘤细胞表面还会过表达大量的MHC  I和抗原肽 的复合物，这些抗原肽绝大部分都是放疗产生的新抗原，将此类新抗原应用于抗肿瘤疫苗 中可提升肿瘤疫苗的抗肿瘤效果，并突破常规肿瘤疫苗易产生免疫逃逸的局限性。
技术实现要素：
： (一)解决的技术问题 本发明旨在提供一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法及应用，用于抗肿瘤疫苗的 制造，解决现有技术中肿瘤细胞抗原组合物的提取和制备较为复杂，存在易发生免疫逃逸 3 CN 111603554 A 说　明　书 2/4 页 的局限性的问题。 (二)技术方案： 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案： 一种抗肿瘤疫苗抗原原料的制备方法，包括以下步骤： 1)获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞； 2)将所述步骤1)得到的所述原代肿瘤细胞进行放疗处理，收集放疗后肿瘤细胞； 3)将所述步骤2)中收集到的放疗后的所述肿瘤细胞进行破碎、梯度离心，即得到 抗肿瘤疫苗抗原原料。 所述步骤3)中进行破碎的方式包括冻融细胞破碎法、低渗张力溶液细胞破碎法和 超声细胞破碎法。所述梯度离心包括第一离心和第二离心，其中第一离心转速为500- 2000g，时间为20分钟，获得上清，再将所得上清进行第二离心，第二离心的转速为12000- 120000g，时间为60分钟，去上清后得沉淀即为所述抗肿瘤疫苗抗原原料。 所述步骤2)中采用X线放疗，X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV，收集放疗后所 述肿瘤细胞时间为1-8天。 所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。 所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100, 人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系HONE1，小鼠黑色素瘤 细胞系B16，小鼠肺癌细胞系Lewis细胞。 所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。 所述抗肿瘤疫苗抗原原料为卸载新抗原蛋白的磷脂结构，所述抗肿瘤疫苗抗原原 料的携载蛋白量不低于将未经放疗的所述原代肿瘤细胞进行破碎、梯度离心后所得到抗原 原料的携载蛋白量。 所述抗肿瘤疫苗抗原原料在制备抗肿瘤疫苗中的应用。 (三)有益效果： 相对于现有技术，本发明产生的有益效果是：通过对离体肿瘤细胞进行培养获得 的原代肿瘤细胞进行放疗处理后，将收集到的放疗后的肿瘤细胞进行破碎、梯度离心，得到 抗肿瘤疫苗抗原原料，由于抗肿瘤疫苗抗原原料来源于放疗处理后的肿瘤细胞，具有强烈 的免疫刺激性，可以有效的在体内外促进骨髓来源树突细胞成熟，可皮下接种，也可以静脉 全身接种，其免疫刺激原理主要涉及MHC  I和CRT蛋白的高表达，所获得的抗肿瘤疫苗抗原 原料生物安全性和生物相容性好，可以联合载药纳米粒子制备纳米抗肿瘤疫苗，提取和制 备过程简单，不易发生免疫逃逸。 附图说明： 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的 附图作简单地介绍。 图1是本发明实施例二中经受不同放疗剂量的肿瘤细胞CRT表达和MHCI表达的对 照图； 图2是本发明实施例二中抗肿瘤疫苗抗原原料表面CRT和MHC  I的表达实验定量对 照图； 4 CN 111603554 A 说　明　书 3/4 页 图3是本发明实施例三中抗肿瘤疫苗抗原原料针对骨髓来源树突细胞的刺激效应 实验对照图； 图4是本发明实施例三中抗肿瘤疫苗抗原原料针对骨髓来源树突细胞的刺激效应 实验定量对照图； 图5是本发明实施例四中接种抗肿瘤疫苗抗原原料的小鼠免疫评价实验对照图； 图6是本发明实施例四中接种抗肿瘤疫苗抗原原料的小鼠免疫评价实验对照图；