技术摘要：
本发明涉及一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法。本发明的目的在于公开了一种在体外较好地模拟体内血管搏动的力学微环境下，利用人血管壁种子细胞培养出管径大小可调的组织工程血管，克服现有技术制备的血管材料缺乏足够的弹性、力学性能较差的不足，并在此基础上，  全部
背景技术：
心血管疾病是威胁人类健康的严重疾病。缺血性疾病，如动脉粥样硬化性心血管 疾病，是全世界死亡率和发病率的主要原因之一。这些疾病导致了对血管移植物的持续需 求，以解决重建或血管闭塞和动脉瘤等问题。随着移植血管外科手术的并发症、同种异体移 植物的频繁短缺和大动物源性血管的免疫排斥反应等，在20世纪50年代首次引入了人工血 管移植来替代闭塞的动脉血管。然而，尽管在药理学、材料学和设备制造各方面取得了进 展，这些合成血管移植物的植入并未显著降低总死亡率和发病率。合成的小口径血管(直径 ≤6mm)移植物陆续表现出血管的顺应性和通畅率低，以及易感染等缺点。 组织工程血管支架材料目前主要面临的两个难题在于：1、体外静态条件下培养的 小口径血管的胶原含量不足，且缺乏足够的弹性中膜支撑，力学强度弱，不能制备出具有与 正常天然血管相似或相近的力学性能。2、单纯将可降解高分子材料植入体内后，自体细胞 难以黏附生长，特别是内皮细胞，由此导致血管的远期通畅率较低。因此，寻求一种模拟体 内心脏搏动力学微环境构建组织工程血管的方法是具有重大意义的。 细胞衍生基质管状支架可替换受损或患病的血管，作为血管移植物，其模拟正常 血管细胞外基质成分、组合排列方式等，制备、重建或再生血管，且管径大小可调。支架材料 的评判标准包括血管的高顺应性、强力学性能、低血栓性和再生重塑性，最终植入体内后能 否成功的融合。为了培养较好的组织工程血管，重要的是要考虑血管的结构以及血管所处 的微环境。 选取合适的种子细胞对于血管结构是十分关键的，如血管内膜中的内皮细胞可调 节凝血、赋予内膜选择通透性并参与免疫细胞搬运。血管中膜是血管壁最厚的一层结构，主 要含平滑肌细胞，可分泌胶原蛋白和弹性蛋白，而胶原蛋白的微观取向和纤维厚度决定了 细胞外基质的宏观力学性能和嵌入细胞的行为，因此赋予血管一定的力学性能，起到维持 血管张力的作用。同样血管外膜中成纤维细胞也可以分泌胶原蛋白和弹性蛋白，以维持血 管的粘弹性，保证血管的生物力学性能。因此，种子细胞在满足具有增殖能力、避免免疫反 应和可收获性的前提下，应保留原生血管中相关一种或多种细胞类型的合成作用以维持血 管的生理功能，以形成与天然血管相似的组织工程血管。 体内的力学微环境对血管的力学性能的形成影响重大。生理状态下的血管搏动及 血液流动引起的血管张力和剪切应力能够刺激内皮细胞和平滑肌细胞增殖迁移及分泌相 应的生长因子，调节血管的屏障功能、胶原及弹性纤维的形成。因此，不考虑生物力学刺激 因素，构建的血管将缺乏足够的力学强度，不能获得接近正常血管的组织结构及力学性能。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种细胞衍生基质管状 3 CN 111603611 A 说　明　书 2/7 页 支架及其制备方法，该细胞衍生基质管状支架能克服现有技术制备的血管材料缺乏具有生 物活性的胶原蛋白，及与原生血管相当的胶原含量，且弹性、力学性能较差的不足。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细胞衍生基质管状支架，所述细 胞衍生基质管状支架为将细胞接种于可降解支架材料，施加力学刺激培养，获得具有良好 力学性能的组织工程血管，然后进行脱细胞处理而得。 作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述细胞衍生基质由一 种或多种种子细胞或细胞片层在特定微环境下分泌获得。 作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述细胞为人血管内皮 细胞、人主动脉中膜平滑肌细胞、人主动脉外膜成纤维细胞、多能干细胞中的至少一种。 作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述种子细胞在静态及 力学刺激状态下分泌细胞外基质，所述细胞外基质为胶原蛋白、弹性蛋白、葡糖氨基葡聚 糖、蛋白聚糖、生长因子中的至少一种。 作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述可降解支架材料为 聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚酐、聚氨酯、聚氨 基酸-酪氨酸衍生聚碳酸酯中的至少一种。 作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述力学刺激通过容积 泵及其驱动装置和拉力装置提供，所述力学刺激为周向或轴向的力学刺激。 基于力学微环境三维培养的细胞衍生基质管状支架的获得，首先构建力学微环境 的培养系统，该系统包括搏动式和蠕动式的容积泵及其驱动装置和拉力装置，以施加周向 和轴向的力学刺激，其中压力、频率参数可调，所用的泵包含罗叶泵、柏林泵、蠕动泵、注射 器泵。 第二方面，本发明提供了上述细胞衍生基质管状支架的制备方法，包括以下步骤： (1)对可降解支架材料进行预处理：将可降解支架材料制成管状，两端分别与人工 血管缝合固定，然后放入碱溶液中浸泡，随后用纯净水浸泡，冲洗干净，吹干备用； (2)培养体系的组装及消毒：将未缝合的人工血管端和生物反应器相固定，并与循 环管路系统连接，构成封闭的循环系统； (3)将细胞接种于步骤(1)预处理后的可降解支架材料上，静置待细胞在可降解支 架材料上黏附后，泵入完全培养基； (4)静态培养1周，动态培养1～15周，得到组织工程血管，脱细胞处理后，即得细胞 衍生基质管状支架。 作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述培养体系包括容 积泵及其驱动装置和拉力装置，所述培养体系的内部环境为生物反应器，所述培养体系的 外部环境为37℃恒温恒湿无菌培养箱和循环管路系统。 所述三维培养的内部环境即生物反应器的培养体系，在环形可降解材料上接种一 种或多种组合细胞，静置待细胞黏附之后，加适量完全培养基，培养1～15周，期间定期给予 换液维持细胞生长营养所需，随着可降解材料的逐步缓慢降解，允许接种细胞嵌入生长并 分泌胶原蛋白、弹性蛋白、葡糖氨基葡聚糖、蛋白聚糖和生长因子等使血管保留三维结构和 功能蛋白，并具备一定的力学性能。 所述三维培养的外部环境为37℃恒温恒湿无菌培养箱及具有良好且稳定密封性 4 CN 111603611 A 说　明　书 3/7 页 的循环管路系统(由BPT管以及相应的接头连接)，以确保培养体系的无菌性。 本发明生物反应器的材质包含玻璃、硅胶或有机合成材料，由生物材料铸模或3D 打印制备而得。 作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述脱细胞处理为采 用化学方法、物理方法、生物方法中的至少一种去除细胞及残留的核物质。 所述化学方法包括离子洗涤剂(C H A P S、S D S、T r i t o n - 1 0 0 X、S o d i u m  Deoxycholate)、醇和丙酮、酸和碱、低渗高渗溶液单组分及多组分联合使用；所述物理方法 包括压力、机械磨损、震荡搅拌、超临界流体、冻融；所述生物方法包括胰蛋白酶、核酸酶、中 性蛋白酶、胎牛血清、螯合剂-EDTA、EGTA。 作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，细胞衍生基质管状支 架储存于4℃。 本发明的细胞衍生基质管状支架，脱细胞处理后，可进行材料改性，如肝素接枝、 内皮化修饰、基因修饰等处理，以提高血管的抗血栓形成、抗血小板聚集，进而提高该支架 植入后的远期通畅率。 与现有技术相比，本发明的有益效果为： (1)本发明的目的在于较好地模拟了体内心脏搏动力学微环境，克服现有技术制 备的血管材料缺乏足够的弹性、力学性能较差的不足，培养出管径(包括直径≤6mm小口径) 大小可调的组织工程血管，并在此基础上，运用脱细胞技术去除细胞，维持组织工程血管原 有胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和空间结构分布。 (2)本发明构建的组织工程血管脱细胞去除细胞后，可较大程度降低细胞衍生基 质支架的免疫排斥反应，且由于该支架由人源细胞分泌的细胞外基质组成，支架的胶原蛋 白的组成及含量与原生血管相似，使其具有良好的顺应性和生物相容性，植入后具有较好 的抗血栓形成的作用，能够满足血管移植后的通畅性要求。 (3)本发明构建的组织工程血管基于力学微环境三维培养获得，可模拟体内血流 动力学的环境，由此获得的组织工程血管经组织染色切片、双光子和二次谐波、电镜等观察 具有与天然脉管相似的组织结构、成分和力学性能，能承受血流对血管壁的剪切应力和跨 壁压力；在植入体内后，利于自体细胞的嵌入生长，同时脱细胞后具有多种血管生成相关生 长因子连接位点，有利于负载生长因子诱导内皮细胞在表面的粘附及生长，减少血栓的形 成。 附图说明 图1为本发明细胞衍生基质管状支架制备方法的流程图。 图2为本发明力学微环境下培养体系的二维平面图，其中，1-容积泵，2-生物反应 器培养系统，3-PBS  bag，4-磁力搅拌器，5-37℃恒温恒湿无菌培养箱，6-外力驱动装置。 图3为本发明制备过程中组织工程血管所处的力学微环境示意图。 图4为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管的大体实物及切 片染色图，其中，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图；c、d、e图分 别为组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图。 图5为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管的双光子二次谐 5 CN 111603611 A 说　明　书 4/7 页 波成像图，其中，a图为胶原纤维空间排列图，b图为弹性纤维的空间排列图。 图6为本发明基于人主动脉外膜成纤维细胞三维培养的组织工程血管的大体实物 及切片染色图，其中，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图；c、d、e 图分别为组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图。 图7为本发明组织工程血管脱细胞前后纤维排列的示意图。 图8为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管脱细胞前后的切 片染色图，其中a、b、c图分别为脱细胞前组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图；d、e、f图分 别为脱细胞后细胞衍生基质的HE、Masson、EVG染色图。