技术摘要：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用。本发明使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时表达，做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫，在经济方面做到了降低疫苗价格的好处，使用Bac‑to‑Bac表达系统分 全部
背景技术：
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为单链环状无囊膜DNA病毒，属于圆环病 毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的最小动物病毒之一。在 2016年猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3，PCV3)发现之前，PCV分为猪圆环病毒1型 (porcine circoviurs 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(porcine circoviurs 2，PCV2)两种血清 型。PCV1最早于1974年在PK15细胞中被发现；PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征 (porcine multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原之一，具有较强的致病性。 2 0 1 6年 ，P a l i n s k i 等借助宏基因组 测序技术从暴发猪皮炎与肾 病综合征 (porcinedermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)疫情的美国某商品化猪场的患病 猪中发现了一种新病毒，根据该病毒的基因组结构和遗传特性将其归类为新型圆环病毒， 并命名为PCV3。PCV3基因组结构与PCV相似，为单股环状DNA，全长2000bp，包含3个主要开放 阅读框(ORFs)，其中ORF1全长891bp，编码含有296个氨基酸的复制酶(Rep)；ORF2全长645bp 编码含有214个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。另外还有一个开放阅读框ORF3全长693bp，编码 230个氨基酸组成的蛋白。 临床上，猪圆环病毒Ⅲ型(porcine circovirus 3，PCV3)感染的猪多会出现腹下 黑斑、产死胎或木乃伊肽，但种猪采食量和精神状态良好；保育猪多发生混合感染，精神状 态极差、高烧扎堆、腹式呼吸等，发病严重的猪场死亡率超过15％，已给养殖业带来了一定 的经济损失。 PCV3是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒离子直径约17-20nm，无 囊膜。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性同源性仅为30％，而Cap蛋白是PCV诱导动物机体 产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此PCV2疫苗对于PCV3所能提供的保护非常有限。PCV3 作为一种新型病毒，该病毒的病原学研究尚不明确，国内外尚未有分离纯化PCV3的报道，因 此制约了利用灭活疫苗进行防控的思路。 病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一类由病毒的部分或全部结构蛋白 自动组装成的具有与天然病毒结构基本一致的空心蛋白颗粒，不具有病毒的遗传物质，不 能自主复制，作用于机体后能够引起机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其 具有良好的免疫原性、较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染 疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。 目前，PCV2仍然对我国养猪业产生着极大影响的动物疾病，而PCV3在我国也渐渐 呈现出流行趋势，两种病毒具有相似的病理特征，并同诸多其他种类病毒共同存在，两种病 毒都会导致免疫抑制，给养猪业带来极大的损失。目前PCV2的疫苗已经在养猪业种被广泛 应用，但是对于新发现的PCV3来说，目前还没，目前还没有任何临床上的审批报道。 综上所述，提供可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒具有重要的现实意 3 CN 111549067 A 说 明 书 2/6 页 义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒。该病毒 样颗粒用杆状病毒表达系统进行制备，可以用作预防性疫苗预防两种病毒的感染，也可以 作为抗原进行诊断试剂盒的研制。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了重组质粒，包括PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基因和杆状病毒昆虫表达 系统的双表达核载体。 在本发明的一些具体实施方案中，所述杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体为 Bac-to-Bac表达系统。 在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒的构建方法，获得PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至 所述杆状病毒昆虫表达系统上，获得含有PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的重组质粒。 本发明还提供了重组杆状质粒，其构建方法为：将所述的重组质粒转化宿主感受 态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒。 在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为Trans5α大肠杆菌感受态细胞。 本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在表达PCV2Cap和PCV3 Cap蛋白中的应用。 在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在 制备疫苗或检测试剂盒中的应用。 此外，本发明还提供了同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的方法，包括如下步骤： 步骤1：获得PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确 后将目的基因分别克隆杆状病毒昆虫表达系统上上，获得含有PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基 因的重组质粒； 步骤2：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒； 步骤3：将所述重组杆状质粒利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救，转染后 72h时，收取上清病毒液，盲传三代，收取SF9细胞。 本发明还提供了如所述方法获得的同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的病毒样颗粒。 更重要的是，本发明还提供了疫苗或检测试剂盒，包括所述的病毒样颗粒。 Cap蛋白作为PCV2与PCV3的重要结构蛋白，对产生免疫原有着不可或缺的作用，由 于杆状病毒对外源蛋白的良好承载能力，以及可产生类似于天然病毒的结构的VLPs，所以 本发明设计使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时 表达，做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫，在经济方面做到了降低疫苗价格的好 处，本研究中，使用Bac-to-Bac表达系统分别制备PCV2-PCV3 VLPs，分别将PCV2 Cap与 PCV3Cap插入双表达核的在体中。并成功获得用于包装所用的重组杆状病毒VLPs。经 WesternBlot、IFA、透射电镜等方法检测，结果显示成功包装出与天然病毒基本一致的 PCV2-PCV3 VLPs。 4 CN 111549067 A 说 明 书 3/6 页 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 图1示PCV2 Cap PCV3 Cap基因PCR扩增结果； 图2示重组质粒pEASY-PCV2 Cap与pEASY-PCV3 Cap酶切鉴定； 图3示质粒pFBD-PCV-PCV3示意图； 图4示重组质粒pFBD-PCV-PCV3的构建与鉴定； 图5示重组穿梭质粒pFBD-PCV-PCV3的菌液PCR验证； 图6示重组杆状病毒的拯救；其中，A-正常的SF9细胞；B-重组杆状病毒pFBD-PCV3- 1-PCV3-2感染SF9细胞48h病变；C-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞120h病 变； 图7示IFA鉴定Cap蛋白的表达； 图8示重组蛋白rBV-PCV2-PCV3的鉴定； 图9示rBV-PCV2-PCV3病毒滴度； 图10示病毒样颗粒。
本发明涉及生物技术领域，特别涉及PCV2/PCV3二价重组病毒样颗粒及其应用。本发明使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时表达，做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫，在经济方面做到了降低疫苗价格的好处，使用Bac‑to‑Bac表达系统分 全部
背景技术：
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为单链环状无囊膜DNA病毒，属于圆环病 毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的最小动物病毒之一。在 2016年猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3，PCV3)发现之前，PCV分为猪圆环病毒1型 (porcine circoviurs 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(porcine circoviurs 2，PCV2)两种血清 型。PCV1最早于1974年在PK15细胞中被发现；PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征 (porcine multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原之一，具有较强的致病性。 2 0 1 6年 ，P a l i n s k i 等借助宏基因组 测序技术从暴发猪皮炎与肾 病综合征 (porcinedermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)疫情的美国某商品化猪场的患病 猪中发现了一种新病毒，根据该病毒的基因组结构和遗传特性将其归类为新型圆环病毒， 并命名为PCV3。PCV3基因组结构与PCV相似，为单股环状DNA，全长2000bp，包含3个主要开放 阅读框(ORFs)，其中ORF1全长891bp，编码含有296个氨基酸的复制酶(Rep)；ORF2全长645bp 编码含有214个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。另外还有一个开放阅读框ORF3全长693bp，编码 230个氨基酸组成的蛋白。 临床上，猪圆环病毒Ⅲ型(porcine circovirus 3，PCV3)感染的猪多会出现腹下 黑斑、产死胎或木乃伊肽，但种猪采食量和精神状态良好；保育猪多发生混合感染，精神状 态极差、高烧扎堆、腹式呼吸等，发病严重的猪场死亡率超过15％，已给养殖业带来了一定 的经济损失。 PCV3是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒离子直径约17-20nm，无 囊膜。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性同源性仅为30％，而Cap蛋白是PCV诱导动物机体 产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此PCV2疫苗对于PCV3所能提供的保护非常有限。PCV3 作为一种新型病毒，该病毒的病原学研究尚不明确，国内外尚未有分离纯化PCV3的报道，因 此制约了利用灭活疫苗进行防控的思路。 病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一类由病毒的部分或全部结构蛋白 自动组装成的具有与天然病毒结构基本一致的空心蛋白颗粒，不具有病毒的遗传物质，不 能自主复制，作用于机体后能够引起机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其 具有良好的免疫原性、较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染 疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。 目前，PCV2仍然对我国养猪业产生着极大影响的动物疾病，而PCV3在我国也渐渐 呈现出流行趋势，两种病毒具有相似的病理特征，并同诸多其他种类病毒共同存在，两种病 毒都会导致免疫抑制，给养猪业带来极大的损失。目前PCV2的疫苗已经在养猪业种被广泛 应用，但是对于新发现的PCV3来说，目前还没，目前还没有任何临床上的审批报道。 综上所述，提供可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒具有重要的现实意 3 CN 111549067 A 说 明 书 2/6 页 义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了可同时表达PCV2 Cap与PCV3 Cap的病毒样颗粒。该病毒 样颗粒用杆状病毒表达系统进行制备，可以用作预防性疫苗预防两种病毒的感染，也可以 作为抗原进行诊断试剂盒的研制。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了重组质粒，包括PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基因和杆状病毒昆虫表达 系统的双表达核载体。 在本发明的一些具体实施方案中，所述杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体为 Bac-to-Bac表达系统。 在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒的构建方法，获得PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确后将目的基因分别克隆至 所述杆状病毒昆虫表达系统上，获得含有PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的重组质粒。 本发明还提供了重组杆状质粒，其构建方法为：将所述的重组质粒转化宿主感受 态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒。 在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为Trans5α大肠杆菌感受态细胞。 本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在表达PCV2Cap和PCV3 Cap蛋白中的应用。 在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的重组质粒或所述的重组杆状质粒在 制备疫苗或检测试剂盒中的应用。 此外，本发明还提供了同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的方法，包括如下步骤： 步骤1：获得PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因，克隆至pEASY-Blunt载体上，验证正确 后将目的基因分别克隆杆状病毒昆虫表达系统上上，获得含有PCV2 Cap基因、PCV3 Cap基 因的重组质粒； 步骤2：将所述重组质粒转化宿主感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得重组杆状质粒； 步骤3：将所述重组杆状质粒利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救，转染后 72h时，收取上清病毒液，盲传三代，收取SF9细胞。 本发明还提供了如所述方法获得的同时表达PCV2 Cap和PCV3 Cap的病毒样颗粒。 更重要的是，本发明还提供了疫苗或检测试剂盒，包括所述的病毒样颗粒。 Cap蛋白作为PCV2与PCV3的重要结构蛋白，对产生免疫原有着不可或缺的作用，由 于杆状病毒对外源蛋白的良好承载能力，以及可产生类似于天然病毒的结构的VLPs，所以 本发明设计使用杆状病毒昆虫表达系统的双表达核载体对PCV2 Cap及PCV3 Cap进行同时 表达，做到一支疫苗同时针对于两种病毒进行免疫，在经济方面做到了降低疫苗价格的好 处，本研究中，使用Bac-to-Bac表达系统分别制备PCV2-PCV3 VLPs，分别将PCV2 Cap与 PCV3Cap插入双表达核的在体中。并成功获得用于包装所用的重组杆状病毒VLPs。经 WesternBlot、IFA、透射电镜等方法检测，结果显示成功包装出与天然病毒基本一致的 PCV2-PCV3 VLPs。 4 CN 111549067 A 说 明 书 3/6 页 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 图1示PCV2 Cap PCV3 Cap基因PCR扩增结果； 图2示重组质粒pEASY-PCV2 Cap与pEASY-PCV3 Cap酶切鉴定； 图3示质粒pFBD-PCV-PCV3示意图； 图4示重组质粒pFBD-PCV-PCV3的构建与鉴定； 图5示重组穿梭质粒pFBD-PCV-PCV3的菌液PCR验证； 图6示重组杆状病毒的拯救；其中，A-正常的SF9细胞；B-重组杆状病毒pFBD-PCV3- 1-PCV3-2感染SF9细胞48h病变；C-重组杆状病毒pFBD-PCV3-1-PCV3-2感染SF9细胞120h病 变； 图7示IFA鉴定Cap蛋白的表达； 图8示重组蛋白rBV-PCV2-PCV3的鉴定； 图9示rBV-PCV2-PCV3病毒滴度； 图10示病毒样颗粒。
