技术摘要：
本公开涉及方法和包含p38激酶抑制剂和调控DUX4和下游基因的表达的药剂的组合物，所述下游基因包含但不限于ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。公开了用于治疗与异  全部
背景技术：
肌肉营养不良症(MD)是一组以控制移动的骨骼肌的进行性无力和退化为特征的 多于30种不同的遗传疾病。一些形式的MD发生在婴儿期或儿童期，而其它可能直到中年或 年龄更大时才会出现。各种MD疾病在肌无力的分布和程度(一些形式的MD还会影响心肌)、 发病年龄、进展速率和遗传模式方面有所不同。 面肩肱型肌营养不良症(FSHD)是第三种最常见的肌营养不良症，并且困扰着全世 界约1/15,000的人。FSHD是由导致DUX4基因的表观遗传去阻遏的基因突变引起的，这使得 这种疾病在肌肉营养不良症中是独特的。FSHD的主要表现是面部、肩胛带、上臂和躯干的肌 肉无力和消瘦，并且在更严重的情况下会影响下肢。 与FSHD相关的基因突变导致D4Z4染色质结构部分分解，并导致阻遏骨骼肌中的 DUX4(即由D4Z4单元编码的转录因子)失效。占报告的FSHD病例约95％的FSHD1与染色体 4q35的亚端粒区中的大卫星D4Z4重复序列缺失，留下1-10个D4Z4重复序列相关(综述于 Tawil等人，2014)。FSHD2是由染色体18上的含柔性铰链域的染色体结构维持1基因 (SMCHD1)的突变引起的(综述于van  der  Maarel等人，2007)。FSHD1和FSHD2突变两者导致 4q35  D4Z4重复序列阵列处的阻遏损失，从而使肌肉中的编码双同源盒4(DUX4)转录因子的 全长形式的双同源盒4(DUX4)mRNA(DUX4-fl)异常转录(Tawil等人，2014)。所发现的与FSHD 相关的DUX4-fl  RNA同种型仅在3'非翻译区有所不同，并且没有鉴定的功能区别。 目前还没有可以终止或逆转FSHD效应的经过批准的治疗方法，即使经常开具非甾 体类抗炎药来改善舒适度和移动性。因此，本领域显然需要用于降低DUX4(例如，DUX4-fl  mRNA和/或DUX4蛋白)的表达水平以例如治疗FSHD和其它疾病的新方法。本发明满足了此需 求。 46 CN 111601593 A 说　明　书 2/172 页
技术实现要素：
一方面，提供了一种用于治疗对p38激酶抑制有响应的病症的方法。所述方法包含 向有需要的受试者施用有效量的式V'的p38激酶抑制剂： 或其立体异构体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的 盐。所述方法包含治疗与DUX4基因表达相关的病症，其中用p38激酶抑制剂抑制p38激酶可 以降低所述受试者的细胞中的DUX4表达水平和/或一个或多个下游基因的表达。 另一方面，提供了一种用于治疗面肩肱型肌营养不良症(FSHD)的方法。所述方法 包含向有需要的受试者施用有效量的式V'的p38激酶抑制剂，或其立体异构体、其同位素富 集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的盐。 一方面，提供了一种用于治疗对p38激酶抑制有响应的病症的方法。所述方法包含 向有需要的受试者施用有效量的选自以下式I'-XXIX '中的一个或多个式的p38激酶抑制 剂： 47 CN 111601593 A 说　明　书 3/172 页 48 CN 111601593 A 说　明　书 4/172 页 49 CN 111601593 A 说　明　书 5/172 页 以及 或其立体异构体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的 盐。所述方法包含治疗与DUX4基因表达相关的病症，其中用p38激酶抑制剂抑制p38激酶可 以降低所述受试者的细胞中的DUX4表达水平和/或一个或多个下游基因的表达。 另一方面，提供了一种用于治疗面肩肱型肌营养不良症(FSHD)的方法。所述方法 包含向有需要的受试者施用有效量的选自式I'-XXIX '中的一个或多个式的p38激酶抑制 剂，或其立体异构体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的盐。 一方面，提供了一种用于治疗对p38激酶抑制有响应的病症的方法。所述方法包含 向有需要的受试者施用有效量的选自(本文描述的属I-XIII的)式I-XIII中的一个或多个 式的p38激酶抑制剂，或其立体异构体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学 上可接受的盐。所述方法包含治疗与DUX4基因表达相关的病症，其中用p38激酶抑制剂抑制 p38激酶可以降低所述受试者的细胞中的DUX4表达水平和/或一个或多个下游基因的表达。 另一方面，提供了一种用于治疗面肩肱型肌营养不良症(FSHD)的方法。所述方法 包含向有需要的受试者施用有效量的选自(本文描述的属I-XIII的)式I-XIII中的一个或 多个式的p38激酶抑制剂，或其立体异构体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其 药学上可接受的盐。 一方面，提供了一种用于治疗对p38激酶抑制有响应的病症的方法。所述方法包含 向有需要的受试者施用有效量的p38激酶抑制剂，或其立体异构体、其同位素富集化合物、 50 CN 111601593 A 说　明　书 6/172 页 其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的盐。所述方法包含治疗与DUX4基因表达相关的病 症，其中用p38激酶抑制剂抑制p38激酶可以降低所述受试者的细胞中的DUX4表达水平和/ 或一个或多个下游基因的表达。 在若干个实施例中，提供了一种用于治疗面肩肱型肌营养不良症(FSHD)的方法。 所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的本文所述的p38激酶抑制剂，或其立体异构 体、其同位素富集化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的盐。 附图说明 图1A和1B示出了FSHD肌管中的DUX4蛋白和RNA的表达。图1A包含使用结合DUX4蛋 白和/或DAPI(以检测细胞核)的抗体进行染色的FSHD肌管的显微照片。成熟的FSHD肌管示 出培养物中的肌动蛋白条纹(未示出)和分化的肌管内含有的离散细胞核组中的经过表达 的DUX4蛋白(图1A)。图1B是示出FSHD肌管和来自同基因野生型(健康)对照的肌管中的DUX4  mRNA的相对表达的图表。 图2是示出用DMSO处理的野生型肌管或用FTX-2或DMSO处理的FSHD肌管中所指示 的DUX4调控基因的mRNA表达的图表。对于每个所指示的基因，从左到右的条与用DMSO处理 的野生型肌管、用DMSO处理的FSHD肌管和用FTX-2(DUX4靶向ASO)处理的FSHD肌管相关。 图3A-3C示出了用DUX4靶向ASO处理的FSHD肌管中的MBD3L2  mRNA的减少。如通过 qPCR所测量的，相对于POLR2A  mRNA对MBD3L2进行归一化。图3A是示出经过分组的板质量对 照数据的图表，所述数据将MBD3L2在用DMSO对照或1μM  DUX4靶向ASO处理的FSHD肌管中与 健康的正常同基因野生型肌管(WT)中的表达进行比较。图3B是示出用不同稀释度的DUX4靶 向ASO(FTX-2)处理的FSHD肌管中的MBD3L2  mRNA表达的剂量依赖性降低的图表。图3C示出 了基于板的分析统计数据，所述分析统计数据将MBD3L2在用DMSO处理的FSHD肌管中与用 DMSO处理的DUX4靶向ASO或野生型肌管中的信号进行比较。 图4A-4D是示出用所指示p38α/β抑制剂处理的FSHD肌管中MBD3L2  mRNA和MYOG  mRNA相对于用DMSO对照处理的表达水平的图表。p38α/β抑制剂包含SB239063(图4A)、VX- 702(图4B)、帕吡莫德(Pamapimod)(图4C)和TAK-715(图4D)。还提供了抑制剂的结构。 图5A和5B示出了来自用帕吡莫德处理的FSHD肌管的数据。图5A是示出DUX4-fl  mRNA(填充圆圈)和MBD3L2  mRNA(空心圆圈)的剂量依赖性减少的图表。图5B示出了用DMSO 或帕吡莫德处理的FSHD肌管的显微照片。 图6A-6C是示出与非靶向对照(NT  CTRL)相比，用靶向p38a  MAPK14的siRNA(图6A 中的siMAPK14  85和图6B中的siMAPK14  86)处理的或用p38a激酶(MAPK14和DUX4  pLAM) Cas9/sgRNA  RNP(图6C)处理的FSHD肌管中的MAPK14(图6A)和MBD3L2(图6B和图6C)的mRNA 水平的图表。在图6C中，对于每种处理，从左到右示出的结果分别对应于MBD3L2和MYOG。 图7是示出在用增加剂量的FTX-1821(所示结构)处理后FSHD肌管中的DUX4蛋白、 MBD3L2  mRNA和p-HSP27蛋白的表达水平占DMSO对照处理水平的百分比的图表。条表示标准 偏差。 图8A和8B示出了FTX-1821对肌管形成的影响。图8A提供了在用媒剂(DMSO)或指示 浓度的FTX-1821处理并用针对MHC和DAPI(核染色)的抗体染色后获得的永生化FSHD肌管的 形态学的代表性图像。图8B是示出在用测试浓度的FTX-1821处理后如由MHC染色所定义的 51 CN 111601593 A 说　明　书 7/172 页 肌管中的细胞核的定量的图表。条表示三个重复的标准偏差。 图9A和9B示出了体外FSHD肌管中的细胞凋亡测定的结果。图9A提供了对活性半胱 天冬酶-3(作为细胞凋亡的标志物)或DAPI染色的FSHD肌管的显微照片。在培养物中的肌管 的子集中以散发性方式检测到细胞凋亡，如左图中的白色圆圈和右侧的放大区所示。图9B 是示出用指示浓度的FTX  1821处理的FSHD肌管中的活性半胱天冬酶-3信号的定量的图表。 图10A和10B展示了通过FTX-1821对FSHD肌管中下调的基因的鉴定。图10A是展示 了通过RNA-seq图谱鉴定的差异表达基因的热图。通过RNA-seq分析每种条件的三个重复， 并按如所指示的变化的方向和强度对基因进行聚类。颜色条指示观察到的归一化变化，例 如在仅用DMSO处理的样品中富集了通过FTX-1821下调的基因。图10A中列出了下调的基因。 图10B是示出在用媒剂对照DMSO处理的野生型细胞、用DMSO处理的FSHD细胞或用FTX-1821 处理的FSHD细胞中，在用FTX-1821处理时被下调的DUX4靶基因的归一化表达水平读段的图 表。 图11是示出在用DMSO媒剂对照、FTX-1821或FTX-839进行所指示的处理后，在源自 四种不同的FSHD患者成肌细胞系FTCE-016、-020、-197、-196和两种野生型(WT)对照系的肌 管中通过DUX4靶基因MBD3L2(相对于POLR2A归一化)的qRT-PCR进行的mRNA表达水平的图 表。 图12A和12B提供了关于各种p38激酶抑制剂的信息。图12A是总结所指示p38α和β 抑制剂的药理学的数据表，包含降低FSHD细胞中的MBD3L2表达的IC50。示出了可比较的 MBD3L2  IC50值，表明跨报道具有类似酶效价的p38α和β抑制剂的广泛结构图对FSHD肌管中 的DUX4下游基因表达的抑制。这些数据表明p38抑制导致DUX4靶基因MBD3L2的IC50值降低范 围为约6-68nM。图12B提供了图12A中列出的p38激酶抑制剂的化合物结构。 图13是在“培养皿中的临床试验”中利用的各种细胞系的表，所述表示出了基因型 的多样性，并且包含原代和永生化细胞系以及FSHD1和FSHD2患者细胞系。 图14A和14B是示出在用FTX-1821、FTX-839或DMSO媒剂对照处理后(通过qRT-PCR) (图14A)相对于POLR2A归一化的MBD3L2  mRNA表达和如通过在九个FSHD1和三个FSHD2患者 肌管(列于表2中，图14B包含仅2个FSHD2细胞系)中确定的切割半胱天冬酶-3(图14B)测量 的细胞凋亡的图表。 图15是示出在口服施用0.3mg/kg  FTX-1821后大鼠的血浆暴露、斜方肌暴露和p38 靶参与(磷酸化p38α:总p38α比率)的时间过程的图表。 图16是示出A4和C6异种移植TA肌肉中的MBD3L2  mRNA水平的图表。 图17是示出用媒剂对照或p38激酶抑制剂FTX-2865处理后小鼠斜方肌中磷酸/总 MC2比率的图表。 图18是示出在用媒剂对照或p38抑制剂FTX-2865处理后C6异种移植TA肌肉中的 MBD3L2  mRNA水平的图表。